[发明专利]一种樟树叶片快速冰冻切片方法

说明书

技术领域

本发明属于显微组织切片技术领域，涉及一种植物冷冻切片的制作，具体是一种樟树叶片快速冰冻切片方法。

背景技术

樟树（Cinnamomumcamphora）为中国亚热带常绿阔叶林中的重要树种，主要分布于长江流域以南各省，是中国特有的珍贵用材和经济树种，富含多糖多酚、萜类等次生代谢物质，是香精香料、油脂化工和医药等的重要原料树种。也是樟科樟属常绿乔木植物中经济价值最大的树种之一，具有较大的开发利用潜力。

随着全球气候的趋于变暖，樟树作为优良的园林绿化树种越来越受到北方城市的青睐。樟树抗寒性的研究对于北方地区成功引种应用樟树资源至关重要，目前有关樟树的抗寒性研究多集中于相关生理生化指标的测定方面。叶片解剖结构鉴定作为评价植物适应性强弱的重要手段，主要是通过不同植物组织切片方法在显微镜下观察其结构的特征而实现。

徒手切片法、石蜡切片法、冷冻切片法是常用的植物组织切片方法。徒手切片法由于样品不固定，切片时容易产生厚薄不匀现象，导致切片不完整；石蜡切片法由于切片前需要对植物材料进行固定、脱水、透明和包埋等一系列步骤，材料容易变形，制作切片过程繁琐。冷冻切片法是利用冷冻包埋剂包埋样品后利用冷冻切片机进行切片的方法，由于植物细胞含水量大，在低温冰冻过程中容易形成冰晶，难以切出结构完整的组织切片，而且细胞内的冰晶会损伤细胞的膜系统，影响其在植物细胞学研究中的应用。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，解决樟树植物组织冰冻切片中存在的容易形成冰晶问题，本发明采用植物材料直接包埋冷冻和适当回温相结合，提供了一种樟树叶片快速冰冻切片方法。

本发明是通过下列技术方案实现：一种樟树叶片快速冰冻切片方法，该方法所使用的冰冻切片机为莱卡CM3050S，它包括切片机降温开关，切片机箱，机头，旋转杠杆，冰冻台；按如下步骤制备：

步骤1）将切取的樟树叶片立即投入到质量分数为4%多聚甲醛固定液中，在4℃下，固定2-3h，用100mmol/L磷酸缓冲液，浸洗2-3次，制得樟树叶片样品，备用。

步骤2）启动切片机降温开关，切片机箱的温度维持在-20℃，冰冻台的温度降低到-20℃。将经过步骤1）处理得到的樟树叶片样品，用OCT冰冻切片包埋剂（opti-mumcuttingtemperaturecompound）均匀涂抹，使樟树叶片样品深埋其中，完成包埋，并迅速冷却固定在样品台上，制得樟树叶片预切样品。

步骤3）将经过步骤2）制得的樟树叶片预切样品连同样品台移至切片机的机头，拧紧机头的螺丝，摇动机身外的旋转杠杆进行修块，修块完成后，将樟树叶片样品台连同包埋块拿出切片机箱，室温下放置20-30s，使包埋块变软，制得樟树叶片样品包埋块。

步骤4）将经过上述步骤3）处理后的樟树叶片样品包埋块，迅速放入切片机箱进行切片，切片厚度为10-20μm，切片过程控制在15-20s完成，制得樟树叶片样品切片。

步骤5）将经过上述步骤4）切好的樟树叶片样品切片，用解剖针轻轻地碰触切片周围的包埋剂，使切片附着在解剖针上，通过解剖针将切片转移到机箱外的载玻片上进行展片。

步骤6）经过步骤5）处理完全展开的切片，直接在切片上进行染色或组织化学分析，显微镜下观察拍照。

所述的步骤1）切取的樟树叶片为新鲜叶片，可以不投入固定液中，直接进行下述步骤。

本发明具有的有益效果：

（1）植物细胞含水量大，低温冰冻由于材料硬度大使得切片容易破碎，本发明采用直接包埋后适当回温，然后切片，得到了结构完整的切片；

（2）植物组织低温冰冻造成冰晶对细胞膜的损伤，而本发明的直接包埋对细胞膜的保持较好；

（3）本发明方法没有加入冷冻保护剂，避免了冷冻保护剂对植物细胞生理状态的影响。

附图说明

图1是樟树叶片横切面图；

图2是樟树叶片主脉横切面图；

图3是冰冻切片机莱卡CM3050S；

图中：1-切片机降温开关；2-切片机箱；3-机头；4-旋转杠杆；5-冰冻台。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例

如图1，图2和图3所示，一种樟树叶片快速冰冻切片方法，该方法所使用的冰冻切片机为莱卡CM3050S，它包括切片机降温开关1，切片机箱2，机头3，旋转杠杆4，冰冻台5；按如下步骤制备：