[发明专利]一种环状RNA人工过表达框架及其表达载体及构建方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种环状RNA人工过表达框架及其表达载体和构建方法。

背景技术

生物体内的环状RNA(CircularRNA)是一类具有特殊功能的RNA分子，而且是客观大量存在的。环状RNA(circRNA)由前体RNA通过剪切，然后由线性RNA的头对尾连接形成，以前的研究由于技术水平的限制，把这部分客观存在的RNA忽略了，随着深度RNA测序及规模化生物信息技术的发展，研究者才真正发现在生物体内大量存在环化的RNA分子，环化RNA由于形成闭合的环状，在生物体内非常的稳定。对于环化RNA的具体功能尚未有明确，目前只有几种假定的说法：(1)环状RNA可以作为“sponge”海绵吸miRNA，抑制其功能；(2)环状RNA通过碱基互补配对直接调控其他RNA水平；(3)环状RNA能与蛋白质结合,抑制蛋白质活性、募集蛋白质复合体的组分或调控蛋白质的活性；(4)环状RNA也可作为翻译的模板指导蛋白质的合成。

基因是具有遗传效应的核苷酸序列，研究特定分子的功能中通过克隆表达基因对研究者来说具有重要意义。为了使克隆的基因在宿主细胞中大量表达，就要依据不同的实验目的选择不同的表达系统，构建不同的表达框架。克隆基因在不同的系统中表达的成功率取决于我们对这些系统中基因表达调控规律的认识程度，以及合理的实验设计。过表达线性的基因技术方法已经非常成熟，可以把要克隆的基因通过PCR技术获得，然后直接连接到表达载体中即可；但是人工过表达环状的RNA分子还存在不少问题，比如：如何人工地使RNA分子在特定位点发生准确环化，从而使生物体内的环状RNA可以通过外显子上下游的内含子发生配对，形成局部双链的RNA，然后通过细胞内的RNA体的剪接生成环状的RNA。

发明内容

本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够有效表达环状RNA的环状RNA人工过表达框架。

本发明的另一个目的是提供含有上述环状RNA人工过表达框架的表达载体。

本发明的再一个目的是提供所述环状RNA人工过表达框架的构建方法。

本发明的再一个目的是提供所述环状RNA人工过表达框架的应用。

本发明的再一个目的是提供一种人工表达目的基因的方法。

为此，本发明提供了一种环状RNA人工过表达框架，其具有如SEQIDNO.1所述的核苷酸序列。

根据本发明的环状RNA人工过表达框架，其特征在于，包括上游框架序列、填充序列、下游框架序列、以及环状RNA插入酶切位点。

术语“上游框架序列”指的是：框架中从第1个碱基算起到492个碱基结束的区域核酸序列。

术语“下游框架序列”指的是：框架中从第636个碱基算起到1017个碱基结束的区域核酸序列。

术语“填充(stuffer)序列”指的是：框架中存在于KpnI、BamHI内切酶中间的核酸序列,用于替换目标序列；如果没有填充(stuffer)序列,KpnI、BamHI紧连着,不容易做酶切。

优选地，所述环状RNA插入酶切位点包括NheI、KpnI、BamHI和XhoI。

其中，该过表达框架的碱基序列中，第1～492bp为上游框架序列，第493～635bp为填充序列，第636～1017bp为下游框架序列，其中，第1～6bp、487～492bp、636～641bp、1012～1017bp依次为酶切位点NheI、KpnI、BamHI、XhoI。

本发明还提供了一种包括所述环状RNA人工过表达框架的表达载体。

优选地，所述的表达载体为真核表达载体。

本发明还提供了一种环状RNA人工过表达框架的构建方法，该方法包括以下步骤：设计扩增引物，以人的HEK293细胞的基因组DNA为模板，采用分段PCR扩增，分别扩增过表达框架的上游框架序列、下游框架序列及填充序列，在全长序列两端分别添加NheI、XhoI酶切位点序列，方便将整个过表达框架连接到质粒载体中；在填充序列两端添加KpnI和BamHI酶切位点序列，用于连接所要研究的目标环状RNA的核苷酸序列。

优选地，在该构建方法中，所述扩增引物分为三段，其核苷酸序列如下：

1)第一段扩增上游框架引物：

Up-F：5'CGCGCTAGCTTCTACATGCGCTCAAGAAAACA3'，

Up-R：5'ATGCTCAGCTGGTACCGCCAAAACAGGTTCAA3'；

2)第二段扩增填充序列引物：