[发明专利]一种环状RNA人工过表达框架及其表达载体及构建方法

权利要求书

1.一种环状RNA人工过表达框架，其具有如SEQIDNO.1所述的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的环状RNA人工过表达框架，其特征在于，包括上游框架序列、填充序列、下游框架序列、以及环状RNA插入酶切位点。

3.根据权利要求2所述的环状RNA人工过表达框架，其特征在于，所述环状RNA插入酶切位点包括NheI、KpnI、BamHI和XhoI。

4.根据权利要求2所述的环状RNA人工过表达框架，其特征在于，该环状RNA人工过表达框架的碱基序列中，第1～492bp为上游框架序列，第493～635bp为填充序列，第636～1017bp为下游框架序列，其中，第1～6bp、487～492bp、636～641bp、1012～1017bp依次为酶切位点NheI、KpnI、BamHI、XhoI。

5.包括权利要求1所述环状RNA人工过表达框架的表达载体。

6.权利要求1至4任一项所述的环状RNA人工过表达框架的构建方法，该方法包括以下步骤：设计扩增引物，以人的HEK293细胞的基因组DNA为模板，采用分段PCR扩增，分别扩增表达框架的上游框架序列、下游框架序列及填充序列，在全长序列两端分别添加NheI、XhoI酶切位点序列，方便将整个表达框架连接到质粒载体中；在填充序列两端添加KpnI和BamHI酶切位点序列，用于连接所要研究的目标环状RNA的核苷酸序列。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述扩增引物分为三段，其核苷酸序列如下：

1)第一段扩增上游框架引物：

Up-F：5′CGCGCTAGCTTCTACATGCGCTCAAGAAAACA3′，

Up-R：5′ATGCTCAGCTGGTACCGCCAAAACAGGTTCAA3′；

2)第二段扩增填充序列引物：

stuffer-F：5′GTTTTGGCGGTACCAGCTGAGCATAGTTC3′，

stuffer-R：5′TTTGGCGGATCCACTGTGAACCACTGAA3′；

3)第三段扩增下游游框架引物：

Down-F：5′TGGTTCACAGTGGATCCGCCAAAACAGGTTCAAG3′，

Down-R：5′GGCCTCGAGAGGAAGTCCAGTTATTAA3′。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述分段PCR扩增的反应体系如下：第一轮PCR为20μl总体系，PCR分别扩增：具体是2×PCRMIX10μl，10mM上下游引物各1μl，HEK293细胞DNA模板1μl，用灭菌水补足20μl体系；第一轮反应条件为：95℃5min预变性，循环内95℃30s变性，60℃30s退火，72℃延伸40s，共35个循环，PCR反应循环后72℃继续延伸7min，然后20℃保存；第一轮PCR反应完取每个片段的PCR产物1μl进行第二轮重叠PCR扩增反应，具体反应体系是50μl：具体是2×PCRMIX25μl，10mM的Up-F和Down-R引物各2.5μl，第一轮PCR产物各段产物总共3μl，用灭菌水补足50μl体系；第二轮反应条件为：95℃5min预变性，循环内95℃30s变性，60℃30s退火，72℃延伸1min,共40个循环，PCR反应循环后72℃继续延伸7min，然后20℃保存。

9.权利要求1所述的环状RNA人工过表达框架应用于人工表达目的基因。

10.一种人工表达目的基因的方法，包括：用KpnI和BamHI酶切除环状RNA人工过表达框架中的填充序列，然后直接将目标基因的核苷酸序列连接到所述环状RNA人工过表达框架中进行表达，其中所述环状RNA人工过表达框架具有如SEQIDNO.1所述的核苷酸序列。