[发明专利]六瓣红大蒜酶解产物HPLC指纹图谱的建立方法

说明书

本发明得到“天津市农委重点项目（201302030）和天津师范大学应用开发研究基金”资助。

技术领域

本发明属于天然植物分析技术领域，涉及天然植物指纹图谱的构建方法，尤其是宝坻“六瓣红”大蒜高效液相色谱(HPLC)指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱。

背景技术

大蒜(AlliumsativumL.)百合科葱属，二年生草本植物，食药兼用，在世界范围内被广泛种植。目前，我国是最大的大蒜生产国，国内种植大蒜69.2万公顷，占世界种植面积的1/2左右，我国大蒜的总产量占世界总产量3/4以上，产量1208.8万吨。大蒜作为人们生活中必不可少的蔬菜和调味品，营养丰富，含有多种对人体有益的化学成分，包括其中含硫挥发物43种，硫化亚磺酸（如大蒜素）酯类13种、氨基酸9种、肽类8种、糖苷类12种、酶类11种等。大蒜鳞茎、幼苗及花茎均可食用。大蒜还具有较强的药用价值，具有杀菌、消炎、抗病毒、抗癌、降血脂等功效。

宝坻特有品种“六瓣红”大蒜，蒜头致密紧实，一般每头6瓣左右，单柱型围座，无加楔，无重瓣，蒜瓣洁白脆嫩，辛辣汁多味浓，易贮藏，耐运输，抗病性较强，辣味柔和适口，生、熟食用俱佳。“六瓣红”大蒜以其优良的农艺性状、丰富的营养成分以及良好的口感，一直保持着名优特产的地位，深受国内外消费者喜爱，已远销日本、韩国及东南亚等多个国家和地区。但由于品质管理技术落后，导致品种出现退化的迹象，成为制约这一名优品种进一步科学化、规模化发展的瓶颈。

指纹图谱技术已成为国际公认的控制中药或天然药物质量的最有效手段之一。它可以较全面、准确、直观的反映多种成分在中药或其制剂中的分布，是一种综合的、宏观的和可量化的鉴别方法。运用指纹图谱技术，通过对指纹图谱中主要特征峰的识别或比例的测定，可以鉴别中药材和中成药的真伪，有效评价产品质量的均一性和稳定性。但是，迄今为止，有关宝坻特有大蒜品种“六瓣红”的指纹图谱还未见报道。

鉴于以上不足，有必要发明一种建立宝坻“六瓣红”大蒜指纹图谱的新方法，使之能够简便、稳定、可重复、全面、精确的评价“六瓣红”大蒜的质量，从而既加强了对“六瓣红”大蒜真伪及产地的鉴别能力，又能提高“六瓣红”大蒜质量的全面评估和控制，弥补了现有检测方法的不足，使之更加科学、完善。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有宝坻“六瓣红”大蒜品质管理检测方法的不足，而提供一种“六瓣红”大蒜HPLC指纹图谱的建立方法。该方法通过将大蒜制备成酶解产物待测溶液，经固相萃取技术分离浓缩，再经由高效液相色谱仪分析检测，获得指纹图谱，为“六瓣红”大蒜的真伪鉴别以及品质控制提供可靠依据和技术方法。

本发明宝坻“六瓣红”大蒜酶解产物HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：该方法按如下的步骤进行：

（1）大蒜酶解产物待测溶液的制备：称取宝坻“六瓣红”大蒜鳞茎20g破碎、研磨，加25-30ml蒸馏水，50-55℃温浴酶解1h，加甲醇定容至50ml，5000×g离心15min，取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤；

（2）大蒜酶解产物供试品溶液的制备：C18固相萃取小柱经5ml甲醇、10ml超纯水活化，平衡15min；待测溶液以4ml/min速度过柱，再用5ml超纯水淋洗，低真空抽干；再由5ml甲醇洗脱后，室温下低流速氮气浓缩至0.5-0.8ml，再以甲醇定容至1ml，经0.45μm微孔滤膜过滤待测；

（3）参照物溶液的制备：称取二烯丙基二硫醚30.44mg和二烯丙基三硫醚32.12mg，溶于甲醇中定容至50ml，再吸取上述混合溶液1ml用甲醇定容至10ml，作为参照物；

（4）高效液相色谱分析：色谱柱为：EclipsePlusC18，5μm，4.6x250mm；保护柱为：EclipsePlusC18Grd，5μm，4.6x12.5mm；柱温35℃；流动相为甲醇和0.2%甲酸水溶液；采用梯度淋洗方式0→2min→10min→20min，甲醇：70%→70%→80%→80%；二极管阵列检测器检测波长240nm；进样量50μL；在上述条件下分析供试品溶液，得到大蒜酶解产物HPLC指纹图谱；

本发明还提供上述大蒜酶解产物HPLC指纹图谱得到的“六瓣红”大蒜解产物HPLC标准指纹图谱。