[发明专利]一种在蛋白质上修饰烯酰基团的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白质分子的化学修饰方法，具体涉及一种在蛋白质上修饰烯酰基 团的方法。

背景技术

化学修饰是一种重要的设计蛋白质的手段。迄今为止，已有多种蛋白质被修饰后在 临床应用中显示出优良性质，如：物理和热稳定性增强，化学性质变化，对酶降解敏感 程度的降低，溶解度的增大，在体内循环半衰期、清除时间的增长，免疫原性和抗原性 的降低及毒性的减小等。修饰蛋白在肽类和非肽类药物、免疫学、诊断学和生物催化等 诸多领域得到越来越广泛的应用。经过化学修饰及修饰的蛋白质不仅较高的维持蛋白质 的生物活性，而且能够有效的克服蛋白质免疫原性和毒性方面的缺点；同时赋予蛋白质 一些新的优良性能。蛋白质的化学修饰技术主要是蛋白质的氨基酸残基修饰技术，是通 过化学试剂对蛋白质肽链上的特定活性基团衍生化，使部分肽键断裂或引入各种功能基 团，包括对氨基酸残基的酰化、去酰胺、磷酸化、糖基化、共价交联、水解以及氧化等。 蛋白质肽链上的活性基团主要有氨基、羟基、巯基等，化学修饰的本质是通过新基团的 引入而改变蛋白质的化学性质、结构、构象以及净电荷、疏水性等，从而改善其功能性 质，如反应特性、溶解性、表面性质、吸水性、凝胶性以及热稳定性等。

一般地说，选择蛋白质修饰剂要综合考虑如下问题：蛋白质的种类和修饰位点，修 饰剂对氨基酸残基的专一性如何；期望的修饰度是多少，在给定的操作条件下，反应是 否可逆；修饰剂的水解稳定性和反应活性，修饰剂后蛋白质的构象是否基本保持不变； 修饰后是否需要进一步分离；是否适合于建立快速、方便、准确的分析方法；修饰剂的 合成是否简便经济，修饰剂是否价廉易得等。

目前报道较多的是PEG酰化修饰蛋白质，如姜忠义等在蛋白质的化学修饰研究进展， 《现代化工》第21卷第8期报道蛋白质的PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯类的修饰。目前 尚未见在蛋白质分子上修饰不饱和碳碳双键；而且目前报道的蛋白质酰化反应条件苛刻， 后处理复杂。

发明内容

本发明第一个目的是提供一种廉价、快速、反应条件易于控制、反应程度高、修饰 效果显著的蛋白质修饰方法；本发明的另一目的是首次提供一种在蛋白质上修饰烯酰基 团的方法，实现在蛋白质分子上修饰不饱和碳碳双键。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种在蛋白质上修饰烯酰基团的方法，其包括：往蛋白质溶液中加入碱后冷却，在0～ 10℃下，往冷却后的蛋白质溶液中加入烯酰氯乙腈溶液进行反应，纯化反应结束后的混 合液得到烯酰化蛋白质。

所述蛋白质溶液中的蛋白质可选自溶菌酶蛋白、牛血清白蛋白等；所述蛋白质溶液 的浓度可为1～10000μmol/L。

所述碱可为碳酸盐或叔胺，所述碳酸盐可选自碳酸钠、碳酸钾等中的至少一种；所 述叔胺可选自三乙基胺、三甲基胺、N,N-二甲基甲酰胺等中的至少一种；所述碱在混 合液中的浓度可为10～100mmol/L。

所述烯酰氯可为丙烯酰氯、甲基丙烯酰氯等；所述烯酰氯与蛋白质的物质的量比可 为1～100；所述烯酰氯乙腈溶液中，乙腈的体积为烯酰氯体积的5～20倍；所述往冷却后 的蛋白质溶液中加入烯酰氯乙腈溶液，加入之前先将烯酰氯乙腈溶液冷却至0～10℃。

所述反应的时间可为5～30min。

反应结束后将混合液转移至截留分子量为5K或10K的超滤离心管中，离心，弃去滤液； 再超滤离心管中加入超纯水，离心，弃去滤液，所得产物即为烯酰化蛋白质。

在一个实施例中，所述一种在蛋白质上修饰烯酰基团的方法，其包括：将0.716g溶 菌酶蛋白溶解于10mL水中，往溶菌酶蛋白溶液中加入53mg碳酸钠固体使得其最终浓度为 50mmol/L，混匀后置于4℃冰箱中冷藏；取45.2mg的丙烯酰氯，用5倍丙烯酰氯体积量 的乙腈稀释配制成丙烯酰氯溶液；将蛋白溶液置于冰水浴中，边振荡边往溶菌酶蛋白溶 液中逐滴加入丙烯酰氯乙腈溶液进行反应，反应10min后取出混合液；将混合液转移至 截留分子量为5K的超滤离心管中，离心，弃去滤液；再超滤离心管中加入超纯水，离心， 弃去滤液，得到丙烯酰化溶菌酶蛋白。