[发明专利]一种定性、定量一体化检测乳品掺次的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是生物分析技术和食品检验领域，是一种定性、定量一体化检测乳品掺次的方法，具体涉及一种从定性甄别食品乳品掺次到定量测定食品乳品掺次程度的完整分析方法。

背景技术

随着社会经济的发展，乳制品由于营养价值高而受到人们的青睐。然而在利益的驱动下，不法商家会在乳制品中掺杂其他物质。比较常见的掺假方式为在乳制品中添加尿素，三聚氰胺等无机氮类，或往优质的乳制品中添加相对劣质的且低成本的蛋白质，比如在羊奶、牛初乳中添加豆奶，在驴奶中掺杂牛奶(PizzanoR,SalimeiE.,2014,J.Agric.FoodChem.,62(25),5853–5858.)等，这些行为损害了消费者的健康和经济利益。因此，建立一种检测乳制品蛋白质的方法显得尤为重要。

常见的蛋白质定量检测方法有凯氏定氮法(Kjeldahl,J.Z.,1883,Anal.Chem.,22,366-382.)、BCA法(Smith,P.K.,Krohn,R.I.,Hermanson,etal,1985,Anal.Biochem.,150,76-85.)、双缩脲法(Cole,E.R.,1969,Rev.PureAppl.Chem.,19,109-130.)、Folin酚法(Lowry,O.H.,Rosebrough,N.J.,Farr,A.,etal,1951,J.Biol.Chem.,193,265-275.)、光谱法(Kennedy,J.F.,White,C.A.,etal,1985,J.FoodChem.,18,95-112.)、紫外吸收法(Layne,E.,1957,Method.Enzymol.,3,447-454.)以及考马斯亮蓝法(Bradford,M.,1976,Anal.Biochem.,72,248-254.)等。但这些方法无法排除非蛋白氮(nonproteinnitrogen,NPN)的干扰(TerenceL.Fodey,ColinS.Thompson,ImeldaM.Traynor,etal,2011,Anal.Chem.,83,5012–5016.)，并且无法定性的鉴别乳品食品是否掺假、掺假蛋白种类、以及定量检测掺假蛋白程度。

目前，能够用于定性甄别乳品食品掺次的方法主要分为两类，一类是基于不同乳品间的蛋白质指纹差异的聚丙烯酰氨凝胶电泳(PAGE技术)(ChrambachA,RodbardD.,1971,Science,172,440-451.)和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳的指纹图谱法(SDS-PAGE技术)(H,VonJagowG.,1987,Anal.Biochem.,166,368-379.)。这类方法仅限于定性的鉴别乳品食品是否掺次，但无法准确甄别掺蛋白质的种类更无法测定掺次的程度。另一类是基于特定的基因系列与特定蛋白抗原的聚合酶链式反应法(PCR技术)(MafraI,FerreiraIM,FariaMA,etal.,2004,J.Agric.FoodChem.,52,4943-4947.)和酶联免疫吸附法(ELISA技术)(PizzanoR,SalimeiE.,2014,J.Agric.FoodChem.,62,5853-5858)。这类方法可以甄别乳制品是否掺次及掺次蛋白种类，但无法定量检测掺次蛋白的程度。

近来，王和史等人提出移动反应界面(MRB)电泳界面阻滞信号(R_MRB)概念和电泳滴定技术(WangH.,ShiY.,YanJ.,etal,2014,Anal.Chem.86,2888-2894.)，揭示了R_MRB与蛋白质浓度的线性关系。该技术的显著特征是在不受NPN干扰的情况下快速低耗的测定样品的蛋白质总含量。并且基于电泳界面阻滞信号概念，曹和张等进一步解决乳品掺次的定量分析问题(专利申请201510140100.9)。但仍然缺少从定性鉴定是否掺次、到甄别掺次蛋白种类、再到定量分析掺次蛋白比率的完整技术路线。造成这种状况的原因是已有的分析技术(如PAGE、SDS-PAGE、PCR和ELISA技术等)与前沿技术(如MRB电泳滴定，专利申请201510140100.9)之间的衔接存在技术路线困难，传统技术与前沿分析技术的整合无法实现上下游技术兼容。

发明内容