[发明专利]一种pKD46-arr-3质粒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及分子生物学和基因工程。

背景技术

质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，广泛存在于许多生物中，习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子，也是分子生物学技术中常用到的一种工具分子。

pKD系列载体主要有pKD3、pkD4、pKD13、pKD32和pKD46等，是通过同源重组方法用来制备细菌基因缺陷株的工具质粒，其中pKD46主要用于革兰阴性杆菌的基因敲除。pKD46的筛选标签是氨苄抗性基因，但是临床菌株的氨苄天然耐药现象很普遍，特别是一些革兰阴性肠杆菌科细菌的氨苄天然耐药尤为普遍，这就限制了pKD46质粒在这些具有氨苄耐药性的菌株中的应用。未解决上述技术问题，本发明由此而来。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种为临床耐氨苄菌株的相关研究提供基因敲除所需的工具质粒。

为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种pKD46-arr-3质粒，所述质粒包括pKD46载体基因片段和利福平抗性基因arr-3。

所述的利福平抗性基因arr-3连接有自身天然启动子，所述启动子序列如SeqNo.6所示。

连接有启动子的利福平抗性基因arr-3全序列如SeqNo.1所示。

所述pKD46载体基因片段为切除了氨苄抗性基因的pKD46载体基因片段，且在原氨苄抗性基因相同的位点连接有自身天然启动子的利福平抗性基因arr-3。本发明通过pKD46载体中的两个PvuI和BssSI酶切位点切除氨苄抗性基因，并在此连接有自身天然启动子的利福平抗性基因arr-3，其序列如SeqNo.1所示。

本发明的第二方面提供了一种具有利福平抗性基因的pKD46-arr-3质粒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)PCR扩增或者合成得到含有PvuI和BssSI酶切位点的带自身自动子的利福平抗性基因arr-3，所述基因片段序列如SeqNo.1所示；

(2)将pKD46质粒和步骤(1)获得的利福平抗性基因arr-3都用PvuI和BssSI酶切后连接；

(3)将步骤(2)获得的连接产物转化受体菌；

(4)鉴定阳性克隆，获得重组质粒pKD46-arr-3。

根据本发明的优选技术方案，利福平抗性基因arr-3还连接有自身天然启动子序列，启动子序列如SeqNo.6所示。

根据本发明的优选技术方案，上述步骤(1)中PCR扩增利福平抗性arr-3的步骤包括：

(A)以经基因组测序验证携带利福平抗性基因arr-3的肺炎克雷伯菌基因组DNA为模板，以P1A(PvuI)/P1B为引物扩增出利福平抗性基因启动子序列,其中，

P1A(PvuI)引物为：GAATCGATCGAACCACTTCATCCGGGGTCA，如SeqNo.2所示；

P1B引物为：GATTTGGCTGCATAACTTTGTTTTAGGGCGACTG，如SeqNo.3所示；

(B)以上述耐利福平的肺炎克雷伯菌基因组DNA为模板，分别以P2A/P2B(BssSI)为引物扩增出利福平抗性基因arr-3的CDS序列，其中

P2A引物为：CAGTCGCCCTAAAACAAAGTTATGCAGCCAAATC，如SeqNo.4所示；

P2B(BssSI)引物为：GCATCTCGTGGCAAAGGACTAGTCTTCAATGACGTG，如SeqNo.5所示；

(C)将步骤(A)和(B)的PCR产物纯化后混合作为模板，以P1A(PvuI)/P2B(BssSI)为引物进行第二轮PCR扩增获得携带启动子的利福平抗性基因arr-3全长。

本发明的具有利福平抗性基因的pKD46-arr-3质粒，经过转入临床分离的耐氨苄的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌等菌株用于靶标基因的敲除。

本发明用利福平抗性基因取代pKD46质粒原有的氨苄抗性筛选标签，通过改造现有的pKD46质粒成携带利福平抗性基因的pKD46质粒，并应用此改造质粒用于具有氨苄抗性菌株的基因敲除。

附图说明

图1为本发明的pKD46-arr-3质粒的构建路线图。

图2为PCR检测利福平抗性基因arr-3电泳图。

具体实施方式