[发明专利]一种pKD46-arr-3质粒及其制备方法有效
| 申请号： | 201510541982.X | 申请日： | 2015-08-28 |
| 公开（公告）号： | CN105039378A | 公开（公告）日： | 2015-11-11 |
| 发明（设计）人： | 张海方;杜鸿;王敏;朱雪明;谢小芳;周惠琴;郑毅 | 申请（专利权）人： | 苏州大学附属第二医院 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/74;C12N15/66 |
| 代理公司： | 苏州创元专利商标事务所有限公司 32103 | 代理人： | 范晴 |
| 地址： | 215004 *** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 pkd46 arr 质粒 及其 制备 方法 | ||
1.一种pKD46-arr-3质粒，其特征在于，所述质粒包括pKD46载体基因片段和利福平抗性基因片段arr-3。
2.根据权利要求1所述的pKD46-arr-3质粒，其特征在于，所述的arr-3基因片段连接有启动子，所述启动子序列如SeqNo.6所示。
3.根据权利要求2所述的pKD46-arr-3质粒，其特征在于，连接有所述启动子的利福平抗性基因片段arr-3全序列如SeqNo.1所示。
4.根据权利要求1-3任一项所述的pKD46-arr-3质粒，其特征在于，所述pKD46载体基因片段为切除了氨苄抗性基因的pKD46载体基因片段，且在原氨苄抗性基因相同的位点连接有启动子的利福平抗性基因片段arr-3。
5.制备pKD46-arr-3质粒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)PCR扩增或者合成得到含有PvuI和BssSI酶切位点的带自身启动子的利福平抗性基因arr-3，所述基因片段序列如SeqNo.1所示；
(2)将pKD46质粒和步骤(1)获得的利福平抗性基因arr-3片段都用PvuI和BssSI酶切后连接；
(3)将步骤(2)获得的连接产物转化受体菌；
(4)鉴定阳性克隆，获得重组质粒pKD46-arr-3。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，利福平抗性基因arr-3还连接有arr-3自身天然的启动子序列，所述启动子序列如SeqNo.6所示。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，上述步骤(1)中PCR扩增利福平抗性基因的步骤包括，(A)以经基因组测序验证携带耐利福平抗性基因arr-3的肺炎克雷伯菌基因组DNA为模板，以P1A/P1B为引物扩增出利福平抗性基因启动子序列,其中，
P1A引物为：GAATCGATCGAACCACTTCATCCGGGGTCA，如SeqNo.2所示；
P1B引物为：GATTTGGCTGCATAACTTTGTTTTAGGGCGACTG，如SeqNo.3所示；
(B)以上述耐利福平的肺炎克雷伯菌基因组DNA为模板，分别以P2A/P2B为引物扩增出利福平抗性基因arr-3的CDS序列，其中
P2A引物为：CAGTCGCCCTAAAACAAAGTTATGCAGCCAAATC，如SeqNo4所示；
P2B引物为：GCATCTCGTGGCAAAGGACTAGTCTTCAATGACGTG，如SeqNo.5所示；
(C)将步骤(A)和(B)的PCR产物纯化后混合作为模板，以P1A/P2B为引物进行第二轮PCR扩增获得携带启动子的利福平抗性基因arr-3全长。
8.如权利要求1所述的pKD46-arr-3质粒，转入耐氨苄的大肠杆菌或肺炎克雷伯菌用于靶标基因的敲除。
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