[发明专利]一步法高分辨率溶解曲线分型鉴定戊型肝炎病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及戊型肝炎病毒基因型的鉴定，具体地说是一种一步法高分辨率溶解曲线分型鉴定戊型肝炎病毒的方法。

背景技术

戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)引起的一种危害严重的急性传染性疾病，其临床表现与甲型肝炎类似，但病死率更高，患病孕妇的病死率更可高达21％。HEV主要通过粪-口传播，经常引起水源性暴发和食源性暴发。自1955年印度发生第一次大暴发以来，戊型肝炎已在亚洲、非洲与拉丁美洲的众多发展中国家广泛流行。近年来该病亦在日本等发达国家散发流行。我国是戊型肝炎高发的国家，新疆、辽宁、山东等省均有大量流行。1986～1988年我国新疆地区曾爆发水型戊型肝炎疫情，近12万人发病，死亡707例，极大地危害了人类健康。由于HEV可能通过直接接触或以水、食物等为媒介在动物和人之间传播，引起戊型肝炎在人群或动物种群中广泛流行，严重危害人群健康，这提示了HEV在公共卫生和食品安全方面存在重要意义。快速准确的基因分型则有助于感染毒株的分子流行特征调查和污染源溯源，从而对污染源进行跟踪与监控。

发明内容

本发明利用戊型肝炎病毒两套扩增引物的Tm值差异，建立基于一步法套式RT-PCR扩增的高分辨率溶解曲线分型鉴定戊型肝炎病毒的方法，以实现对戊型肝炎病毒基因型的快速分型。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案：一步法高分辨率溶解曲线分型鉴定戊型肝炎病毒的方法，其步骤如下：

1)HRM引物的设计

对比分析已发表的不同来源1、3、4型HEV全基因序列，针对其ORF3序列设计一对外侧引物和一对内侧引物，外侧引物Tm的值低于内侧引物的Tm值，所述的外侧引物为：GAA+TGA+ATAA+CAT+GT，TGGTCACGCCAAG，所述的内侧引物为：CCGGCGGTGGTTTCTGG，GCGAAGGGGTTGGTTGGATGAATAT；

所述的两对引物在套式PCR反应中对样本中的不同基因型HEV毒株均能扩增；同时，不同种基因型的扩增产物之间存在一个或多个固定的碱基突变位点，以获得不同的高分辨率溶解曲线峰型，满足HRM对于HEV基因型的鉴定分析；

2)HRM分型鉴定

在每个样品测试管中加入200x RT-Enzyme solution 0.1μL，5x RT-PCR Reaction Mix4.0μL，20μM外侧引物各0.4μL，20μM内侧引物各0.8μL，10×饱和染料LC green 2μL，去离子水3.5μL，最后加入样本RNA 8μL，500r/min离心30s，置于荧光定量PCR仪中进行一步法高分辨率溶解曲线分型鉴定。

本发明设计HEV保守扩增探针，并结合不同基因型的扩增产物中的固定位点碱基突变，建立具有高分辨率峰型的HRM分型鉴定方法。高分辨率溶解曲线分析技术可对食品中或保存的HEV毒种进行基因型鉴定，具有高特异性和高灵敏度，且无需测序和后期分析即可完成快速检测和基因分型，大大提高了检测效率，降低了使用成本。

进一步，所述PCR的反应条件如下：

第一阶段，反转录55℃/20min；

第二阶段，预变性95℃/30s；

第三阶段，95℃/5s，54℃/15s，72℃/30s 15个循环；

第四阶段，95℃/5s，60℃/15s，72℃/20s 35个循环；

第五阶段，95℃/1min，44℃/1min；升温至80℃，15次读数/℃；

分析样本的溶解曲线和峰型，确定HEV的基因型。

本发明具有如下的有益效果：基于荧光定量PCR的高分辨率溶解曲线分析技术(HRM)，不仅有着很高的特异性和灵敏度，而且在达到快速检测目的的同时可进行有效的突变点或基因分型分析，无需测序和后期分析，大大降低了检测筛查用时及成本，实现了真正的闭管操作，有效避免了因操作导致的交叉污染。

附图说明

图1为不同HEV基因型溶解曲线峰型图。

具体实施方式

高分辨率溶解曲线分型鉴定戊型肝炎病毒的方法，其步骤如下：

1.HRM引物设计