[发明专利]一步法高分辨率溶解曲线分型鉴定戊型肝炎病毒的方法

权利要求书

1.一步法高分辨率溶解曲线分型鉴定戊型肝炎病毒的方法，其对食品中的HEV毒种进行基因型鉴定，包括如下步骤：

1)HRM引物的设计

对比分析已发表的不同来源1、3、4型HEV全基因序列，针对其ORF3序列设计一对外侧引物和一对内侧引物，外侧引物Tm的值低于内侧引物的Tm值，所述的外侧引物为：GAA+TGA+ATAA+CAT+GT，tggtcacgccaag，所述的内侧引物为：CCGGCGGTGGTTTCTGG，GCGAAGGGGTTGGTTGGATGAATAT；+T，+A，+C，+G为经LNA修饰的碱基；

所述的两对引物在套式PCR反应中对样本中的不同基因型HEV毒株均能扩增；同时，不同种基因型的扩增产物之间存在一个或多个固定的碱基突变位点，以获得不同的高分辨率溶解曲线峰型，满足HRM对于HEV基因型的鉴定分析；

2)HRM分型鉴定

在每个样品测试管中加入200x RT-Enzyme solution 0.1μL，5x RT-PCR Reaction Mix 4.0μL，20μM外侧引物各0.4μL，20μM内侧引物各0.8μL，10×饱和染料LC green 2μL，去离子水3.5μL，最后加入样本RNA 8μL，500 r/min离心30s，置于荧光定量PCR仪中进行一步法高分辨率溶解曲线分型鉴定。

2.根据权利要求1所述的一步法高分辨率溶解曲线分型鉴定戊型肝炎病毒的方法，其特征在于，所述PCR的反应条件如下：

第一阶段，反转录55℃/20 min；

第二阶段，预变性95℃/30s；

第三阶段，95℃/5s，54℃/15 s，72℃/30 s 15个循环；

第四阶段，95℃/5s，60℃/15 s，72℃/20 s 35个循环；

第五阶段，95℃/1min，44℃/1min；升温至80℃，15次读数/℃；

分析样本的溶解曲线和峰型，确定HEV的基因型。