[发明专利]一种检测辣椒黄脉病毒的RT-LAMP引物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于植物病毒检测领域，具体涉及一种检测辣椒黄脉病毒的RT-LAMP引物及试剂盒。

背景技术

辣椒黄脉病毒(Pepperveinyellowvirus，PeVYV)属黄症病毒科(Luteoviridae)马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)成员，由蚜虫持久方式传播，可以嫁接传播。该病毒在欧洲的西班牙、荷兰，非洲的马里、苏丹，亚洲的印度、印度尼西亚、菲律宾、泰国、日本、中国台湾以及北美洲的美国等地均有分布。2013年以来，先后在我国的湖南、山东和广东等3省份也发现辣椒黄脉病毒，田间症状主要表现为叶脉黄化、叶片卷曲、节间缩短等，严重影响到辣椒的产量和品质。目前，检测辣椒黄脉病毒(Pepperveinyellowvirus，PeVYV)的方法主要是反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法。RT-PCR检测方法主要包括：根据已知病毒保守序列设计RT-PCR引物，提取病样中的总RNA，以其中的病毒基因组RNA作为模板，在PCR管中加入逆转录酶、模板、RT-PCR反应成分，PCR仪上进行反应及琼脂糖凝胶电泳检测等步骤。该方法特异、较灵敏，但需要购买专业仪器PCR仪，且较为费时。目前利用RT-PCR检测病毒需要6小时左右。

环介导等温扩增(loopmediatedisothermalamplification，LAMP)技术，是利用能识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具解旋功能且呈瀑布式扩增的BstDNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速和特异地扩增靶序列。LAMP呈瀑布式扩增，其扩增效率非常高，反应非常灵敏；利用识别靶序列上的6～8个特异性位点，其特异性很高；反应在60～65℃恒温下进行，只要水浴锅即可，无需特殊的仪器，操作非常简单；整个检测反应只需1.0～1.5h，检测周期短。因此，该方法具有检测速度快、灵敏度高及不需要昂贵的专业仪器等优点。

发明内容

为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种检测辣椒黄脉病毒的RT-LAMP引物。

本发明的另一目的在于提供一种含有上述RT-LAMP引物的辣椒黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒。

本发明的第三个目的在于提供一种利用上述RT-LAMP引物或RT-LAMP检测试剂盒检测辣椒黄脉病毒的方法，该方法快速、灵敏、简便。

本发明的第四个目的在于提供上述RT-LAMP引物或RT-LAMP检测试剂盒的应用。

一种检测辣椒黄脉病毒的RT-LAMP引物，包括一对外侧引物F3和B3以及一对内侧引物FIP和BIP，其核苷酸序列如下所示：

F3:GATCACGTAACACCCGCC；

B3:GCTCTCTGATAGAGACGGCC；

FIP:GCCTCCATTTCGTCGTCTTCGA-GTTCGCCCTGTCGTTGTG；

BIP:TTGGAGGAAGGTCGAGCAACAG-AAGGTGACAGATCCTGAGGA；

一种辣椒黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒，包含上述RT-LAMP引物；

所述的辣椒黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒，优选包含如下组分：上述RT-LAMP引物；RT-LAMP反应液；酶溶液；核酸荧光染料；

所述的RT-LAMP反应液优选包含如下组分：Tris-HCl(pH8.8)40mM；KCl20mM；MgSO₄16mM；(NH₄)₂SO₄20mM；Tween200.2％(w/w)；Betaine1.6M；dNTPs每种2.8mM；

所述的酶溶液优选为BstDNA聚合酶和AMV逆转录酶的混合溶液；

所述的核酸荧光染料优选为荧光目视检测试剂(容研生物科技(中国)有限公司产品)；

一种检测辣椒黄脉病毒的方法，包含如下步骤：

以待测样品的RNA为模板，利用RT-LAMP引物或RT-LAMP检测试剂盒进行RT-LAMP扩增反应；反应结束后观察RT-LAMP扩增反应溶液颜色变化，若反应液显绿色，则判断为阳性反应；若反应液显橙色，则判断为阴性反应；