[发明专利]一种体外刺激外周血γδT细胞高效增殖的方法及其应用

说明书

本发明属于医学生物工程领域，具体涉及一种体外刺激外周血γδT细胞高效增殖的方法及其应用。扩增方法包括使用饲养层细胞，OKT3抗体，白细胞介素‑2和唑来膦酸。上述饲养层细胞是一种K562细胞在其基因组的靶向位点上特异性的插入了CD64，CD86，和CD137L基因。用唑来膦酸和白细胞介素‑2增加外周血γδT细胞比例后，基因的蛋白产物与OKT3抗体和白细胞介素‑2联合作用，可刺激γδT细胞大量扩增。扩增后的γδT细胞可用于杀死唑来膦酸预处理过的肿瘤细胞或经基因工程手段修饰表达嵌合性抗原受体(CAR)来直接杀死肿瘤细胞。此方法获得的γδT细胞具备完整的抗肿瘤细胞毒性，可杀死实体肿瘤细胞和非实体肿瘤细胞。

技术领域

本发明属于医学生物工程领域，具体涉及一种体外刺激外周血γδT细胞高效增殖的方法及其应用。

背景技术

过继细胞免疫治疗是癌症治疗的一种强有力的手段，该治疗采用体外方法大量扩增T细胞。″快速扩增程序(REP)″是一种生产出大量的T淋巴细胞行之有效且常规使用的方法。快速扩增程序是一种抗原非依赖性的方案，该方案采用过量的致死剂量伽玛辐照异体外周血单个核细胞(PBMC)作为饲养层细胞，同时使用抗CD3抗体(OKT3)和外源重组人白细胞介素(rhIL)-2。白细胞介素-2是一种T细胞增殖和生长所需的强有力的T细胞有丝分裂原。外周血表达Fc-γI受体(FcγRI)，它可以与抗CD3抗体免疫球蛋白(Ig)的Fc段相互作用。作为一种抗CD3抗体，OKT3可绑定到T细胞表面的T细胞受体(TC R)-CD3-复合物上。抗CD3-T细胞受体交联以及通过绑定到CD3的抗体Fc而产生的T细胞和外周血单个核细胞之间的相互作用，可同时提供信号1和共刺激信号-2，导致T细胞增殖而不会引发无能或早期凋亡。这种快速扩增程序可以致使T淋巴细胞在14天内扩增1000倍。

虽然快速扩增程序是一种常用的方法，但它的应用受到材料和技术上的限制。在临床应用快速扩增程序时，一个T细胞中通常会用200个外周血单核细胞来刺激。所以快速扩增程序需要用血细胞分离机大容量白细胞单采术从多个健康的捐助者收集大量异体外周血单个核细胞。快速扩增方案中所收集的外周血单个核细胞来自异体，需要经过大量的实验室检测，以确认处于无菌状态，这可能既昂贵又费时。由于外周血单个核细胞来自于多个捐助者，收集而来的外周血单个核细胞对T细胞扩增的维持作用在捐助者个体间可能会表现出很大的差异性。所有这些问题都会对大型多中心随机临床试验有所妨碍。

为了克服以上快速扩增程序的问题，基因工程改造过的人类红白血病细胞株K562细胞已经被用来取代外周血单个核细胞。K562细胞本身既不表达内源性的HLAII类分子(因此减少了同种异体反应)，也不表达诸如CD86、CD83、4-1BBL、OX40L、ICOSL(B7H2，B7RP1)或CD40L等共刺激分子。K562细胞也不表达抑制分子，如PDL1(B7H1)，PDL2(B7DC)，B7H3和B7H4(B7X，B7S1)。在三种人类IgG Fc受体中，K562细胞内源性高表达CD32，而CD16或CD64并不会高表达。K562细胞表达黏附分子CD54(ICAM-1)和CD58(LFA-3)，这会增强K562细胞与T细胞间的相互作用并提高T细胞的增值效率。基因工程改造K562很容易进行，转基因在改建后的K562细胞中的表达比较稳定。多项临床试验已证实使用K562为饲养层细胞进行T细胞扩增是一种安全可靠的方法。

绝大多数T淋巴细胞属于αβT细胞。它们的T细胞受体由α和β链组成。一个小部分T淋巴细胞表达T细胞受体gamma和delta异二聚体(γδ)链。γδT细胞在肿瘤和感染的免疫监视方面起到重要作用。γδT细胞能够渗入人体实体肿瘤内部，影响肿瘤生长并且杀死癌细胞。能被γδT细胞渗入实体肿瘤包括肾癌、膀胱癌、卵巢癌、结直肠癌、乳腺癌和鼻咽癌。Vγ9Vδ2T细胞是人类外周血γδT细胞的主要亚群，几个早期阶段的过继免疫治疗癌症的临床试验已经使用了Vγ9Vδ2T细胞。