[发明专利]一种体外刺激外周血γδT细胞高效增殖的方法及其应用

权利要求书

1.一种体外刺激外周血Vγ9Vδ2T细胞高效增殖的方法，其特征在于，所述方法为：

1)将目的基因CD64，CD86，和CD137L插入到K562细胞的基因座中得到单克隆细胞株；

2)从外周血中分离单个核细胞，并用唑来膦酸和白细胞介素-2预处理外周血单个核细胞；

3)预处理过的外周血单个核细胞与遗传修饰过的K562细胞共同培养，并加入OKT3抗体和白细胞介素-2。

2.如权利要求1所述的体外刺激外周血Vγ9Vδ2T细胞高效增殖的方法，其特征在于，所述基因座为人类第19号染色体AAVS1基因座。

3.如权利要求1所述的体外刺激外周血Vγ9Vδ2T细胞高效增殖的方法，其特征在于，所述方法的步骤1)的具体步骤为：采用锌指核酸酶技术，以位点特异性的方式引导将目的基因插入到K562细胞人类第19号染色体AAVS1基因座；然后用嘌呤霉素对改造后的K562细胞进行筛选，以获得单克隆细胞株；最后用流式细胞仪分析筛选得到的高表达目的基因的单细胞克隆株。

4.如权利要求1所述的体外刺激外周血Vγ9Vδ2T细胞高效增殖的方法，其特征在于，所述方法的步骤2)的具体步骤为：先用淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法从白细胞层将外周血单个核细胞分离出来，再将外周血单个核细胞种植到孔板中，使用AIM-V培养基，并加入唑来膦酸和人类重组白细胞介素-2刺激外周血单个核细胞。

5.如权利要求4所述的体外刺激外周血Vγ9Vδ2T细胞高效增殖的方法，其特征在于，所述唑来膦酸为5μM；所述OKT3抗体为50ng/ml。

6.如权利要求5所述的体外刺激外周血Vγ9Vδ2T细胞高效增殖的方法，其特征在于，所述人类重组白细胞介素2为300IU/ml；外周血单个核细胞的密度2×10⁶/ml。

7.如权利要求1所述的体外刺激外周血Vγ9Vδ2T细胞高效增殖的方法，其特征在于，所述方法的步骤3)的具体步骤为：当细胞激活并扩增后，用修饰过的K562细胞，OKT3抗体，白细胞介素2和唑来膦酸混合物共培养细胞，进行Vγ9Vδ2T细胞扩增；共培养时添加OKT3抗体，重组人白细胞介素-2和唑来膦酸促进Vγ9Vδ2T细胞进一步增殖。

8.如权利要求7所述的体外刺激外周血Vγ9Vδ2T细胞高效增殖的方法，其特征在于，所述K562细胞扩增使用前先经γ辐照或与混有丝裂霉素C处理灭活。

9.如权利要求1-8任一所述的体外刺激外周血Vγ9Vδ2T细胞高效增殖的方法在制备Vγ9Vδ2T扩增试剂盒中的应用；所述Vγ9Vδ2T扩增试剂盒内的试剂包括遗传修饰过的K562细胞、OKT3抗体、白细胞介素-2和唑来膦酸。

10.如权利要求1-8任一所述的体外刺激外周血Vγ9Vδ2T细胞高效增殖的方法在制备细胞免疫药物中的应用。