[发明专利]小麦黄花叶病毒双抗夹心生物素-亲和素ELISA检测方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种小麦黄花叶病毒双抗夹心生物素-亲和素ELISA检测方法及应用。

背景技术

小麦黄花叶病毒(Wheatyellowmosaicvirus，WYMV)是一种由禾谷多黏菌(PolymyxagraminisL.)传播的麦类土传病毒，禾谷多黏菌是一种专性寄生于植物根部的真核低等生物，该介体分布范围广，可在30多种禾谷类作物和杂草上寄生，且拥有抗逆性很强的休眠孢子和完成侵染循环的游动孢子，只要条件适宜，即可激发游动孢子携带病毒侵染寄主的根系，造成严重的病害。小麦黄花叶病由日本的Sawada在1927年首次发现并描述，至今仍是麦类生产上的一种重要病害。在自然条件下WYMV常与中国小麦花叶病毒(Chinesewheatmosaicvirus，CWMV)复合侵染小麦，导致严重的田间病害，这两类病毒都属于真菌传棒状病毒组，电镜下观察病毒粒子为直棒状二分体。

小麦黄花叶病主要分布在日本、韩国和中国。我国目前主要分布于长江、黄河中下游和淮河流域，包括四川、陕西、江苏、浙江、安徽、湖北、山东和河南等省，其中江苏省的里下河地区和宁镇扬丘陵地区、湖北省东北沿大别山地区、陕西省渭河流域关中地区发生较重。该病害已经成为我国冬小麦产区的一种重要的病毒病，对小麦的产量和品质有严重影响。一般病田发病减产10％-30％，严重的达70％-80％，甚至绝收。为了监测和防控小麦黄花叶病的发生和扩散，急需建立该病害的高度特异和灵敏的检测方法。

目前，对病害的检测方法主要有直接观察法、分子生物学法和血清学方法。症状观察是判断田间发病情况的一种比较常用和直观的方法。但由于发病症状的相似性，隐症现象，以及复合侵染的情况，所以这种方法一般情况下判断不够准确。RT-PCR的检测方法虽然比较灵敏且特异性好，但由于它的花费成本大且仪器要求高，一般局限于实验室用。综合而言，血清学方法操作简便、特异性好、灵敏度高且成本低，更适用于田间大规模样品的检测，并易于在基层进行推广。WYMV的血清学检测方法是通过制备抗血清，利用ELISA或Westernblot对病毒进行检测和研究。向荣等和韩成贵等分别制备了WYMVP1和CP的抗血清，可以通过ELISA或Westernblot等血清学手段检测病毒；尚巧霞等建立了WYMVELISA检测系统。但这些以多抗建立的血清学方法未见其在田间样品大规模检测中应用的报道。因此本实验室利用提纯的WYMV病毒粒子为免疫原，经杂交瘤技术获得了几株能够高效分泌抗WYMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株，利用杂交瘤细胞制备了腹水单抗。在常规以单抗为核心建立的能准确检测小麦中WYMV的ACP-ELISA、TAS-ELISA、dot-ELISA等血清学方法的基础上，有研究表明生物素-亲和素(Biotin-Avidin)技术是近年来发展迅速的一门生物学技术，依靠其高度的特异亲和性、复合物的稳定性、可与酶及固相载体等的偶联性、多级放大性等特点，现已广泛应用于生物学、分子生物学、生物化学、临床医学等，目前应用于植物病毒的检测上还较少，基于提高WYMV血清学检测方法的灵敏度、特异性、可操作性和推广性等方面，本研究对WYMV抗体进行了配对筛选和生物素标记，建立了WYMV双抗夹心生物素-亲和素ELIAS检测方法，并成功应用于田间小麦黄花叶病毒的检测，为WYMV田间大规模快速检测的实现提供了物质和技术支撑，从而推动了小麦黄花叶病的预报预警和科学防控体系的建立。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种操作简便、费用低廉、灵敏度高、特异性强、应用广泛且适合大量样本检测的小麦黄花叶病毒(WYMV)双抗夹心生物素-亲和素ELISA检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种小麦黄花叶病毒双抗夹心生物素-亲和素ELISA检测方法，包括以下步骤：

1)每孔用100uL病毒特异性抗体包被酶标板，37℃放置2h后，4℃过夜放置，洗板，甩干；

2)每孔加入200uL含10％小牛血清的磷酸盐缓冲液，37℃孵育2h，洗板，甩干；

3)每孔分别加入100uL待检病毒样品、阳性和阴性样品，37℃孵育1h，洗板，甩干；

4)每孔加入100uL生物素标记的二抗，37℃孵育1h，洗板，甩干；

5)每孔加入100uL亲和素标记的酶，37℃孵育1h，洗板，甩干；

6)每孔加入100uL显色底物，37℃孵育5～15min进行显色反应，肉眼观察显色后每孔加入100uL终止液，用酶标仪测定OD值，以大于等于阴性对照OD值3倍的作物阳性结果的阈值。