[发明专利]一种三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体及制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域中的基因工程技术领域，涉及一种三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体及制备方法

背景技术

在转基因动物中外源基因的高效表达必须依赖好的表达载体。更需要多基因，组织特异性共表达的载体。

MSTN，又称肌肉生长抑制素，属于转化生长因子β超家族成员，1997年McPherron、Lawler首次制备了MSTN基因敲除小鼠^[1]，证实它最重要的功能即对骨骼肌的生长与发育负调控骨骼肌生长。MSTN作为一种分泌型蛋白主要由骨骼肌产生，在不同物种中MSTN基因都由3个外显子(exon1/2/3)和2个内含子(intron1/2)组成，在哺乳动物中MSTN的成熟肽序列同源性很高，例如人和牛的相似度为98.2％。自然突变或者通过基因操作手段制备的MSTN功能缺失型的动物(如小鼠、牛、羊等)表现出骨骼肌肥大的双肌效应，是一种常染色体隐性遗传的性状^[2-3]，因此在家畜育种中如何有效阻断或抑制MSTN的表达，如何使MSTN失活成为家畜育种的研究热点。在医学方面抑制MSTN能够增强横纹肌生长，治疗肌肉萎缩，减少肥胖，改善心脏收缩性，因此，更多抑制MSTN表达的基因操作方法在不断的发现和研究中。

核基质结合区(MARs)是真核生物染色质中与核基质或核骨架特异结合的一段DNA序列。MARs参与DNA复制调控和转录调控等多种核生化过程。

MARs的长度一般为300一1000bp，也有的长达几个kb，维持其活性的最小长度约是300bp，MARs是非编码序列，AT含量高达70％，不同的MARs序列不同，但往往含有相似的结构基元，如烟草中发现TM2序列具备一般MARs序列的基本特征：其序列全长1001bp，AT含量为62.8％，序列上含有一个典型的T-box，两个潜在的DNA解旋序列(AATATT)和一个潜在的拓扑异构酶II结合位点(CTTTATATTGTTGAC)。

研究表明，MARs序列的功能包括边界因子(boundaryelement)作用、染色质调节作用、DNA复制起始子的组分、染色体结构组成作用、MARS对转基因表达的调控作用，鉴于MARs与基因表达间的关系，尤其它能显著地增强转基因表达、克服位置效应、消除转基因沉默，它已被作为一种顺式调控元件应用到转基因技术中。

MRF4，肌肉特异启动子，真核生物启动子位于基因5’端上游转录起始位点附近，是包含核心启动子以及上游转录调控元件的一段DNA序列，这些转录调控元件控制着基因表达的强度和特异性。肌肉特异性启动子的上游调控元件种类、数量和排列顺序决定着基因在肌肉中的特异性表达。目前，人们分离了许多肌肉特异性启动子，如骨骼肌α-actin、心肌α-actin、肌肉肌酸激酶(MCK)、肌球蛋白重链(MyHC)、结蛋白(desmin)和生肌调控因子家族(MyoD、Myf5、Mrf4和Myogenin)等肌肉特异性基因的启动子，并对这些启动子的转录活性和其对肌肉细胞的增殖、分化作用进行深入研究]。本MRF4是根据“肌肉特组织特异性启动子生物信息学设计路线”最终优化的MRF4序列，在两端添加Kpnl和Smal酶切位点及保护碱基，将序列送至takara公司，进行人工合成。

FAD3是在植物中发现的一种脂肪酸去饱和酶基因，催化细胞中亚油酸到亚麻酸的反应，研究表明在非光合作用的组织中，FAD3蛋白主要为ω-3去饱和酶的功能，催化组织中约80％三烯脂肪酸的合成。ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3polyunsaturatedfattyacids，PUFA)是组成人体必需的物质，对健康非常重要，ω-6与ω-3PUFA比值过高可导致心血管疾病、癌症、炎症以及自身免疫反应等疑难病。但由于哺乳动物体内缺乏ω-3脂肪酸去饱和酶，自身不能催化合成ω-3PUFA，只能通过饮食获得。