[发明专利]一种三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体及制备方法

权利要求书

1.三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体，其特征在于，基因转移体包括MARs牛核基质结合区、以牛肌肉抑素第三号外显子为靶点的小发夹RNA、MRF4、MRF4为优化合成的肌肉特异启动子、FAD3为人源化n-3去饱和酶基因、IRES为内部核糖体进入位点、DsRed红色荧光蛋白基因和终止信号区SV40polyA，所述独立基因转移体无原核主干载体序列。

2.根据权利要求1所述的三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体，其特征在于，所述的基因转移体的全序列为SEQNO.：17。

3.根据权利要求1所述的三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体，其特征在于，置换CMV的肌肉特异性启动子MRF4的序列为SEQIDNO：9；根据“肌肉特组织特异性启动子生物信息学设计路线”优化MRF4序列，在两端添加Kpnl和Smal酶切位点及保护碱基，将序列送至takara公司，进行人工合成。

4.根据权利要求1所述的三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体，其特征在于，置换U6的MRF4的序列为SEQIDNO：9；通过如下引物进行PCR获得：

MRF4-F正义链，5′到3′：SEQIDNO：1；

MRF4-R反义链，5′到3′：SEQIDNO：2。

5.根据权利要求1所述的三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体，其特征在于，FAD3的序列为SEQIDNO：10；通过如下引物进行PCR获得：

FAD3-F正义链，5′到3′：SEQIDNO：3；

FAD3-R反义链，5′到3′：SEQIDNO：4。

6.根据权利要求1所述的三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体，其特征在于，IRES的序列为SEQIDNO：11；通过如下引物进行PCR获得：

IRES-F正义链，5′到3′：SEQIDNO：5；

IRES-R反义链，5′到3′：SEQIDNO：6。

7.根据权利要求1所述的三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体，其特征在于，DsRed基因为SEQIDNO：12；通过如下引物进行PCR获得：

DsRed-F正义链，5′到3′：SEQIDNO：7；

DsRed-R反义链，5′到3′：SEQIDNO：8。

8.一种三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、，人工合成MRF4，并用MRF4置换初始载体pMAR-shRNA-U6-CMV-FSTN中的CMV，得pMAR-shRNA-U6-MRF4-FSTN；

S2、用克隆的MRF4置换pMAR-shRNA-U6-MRF4-FSTN中的U6，得pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FSTN；

S3、用克隆的FAD3置换pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FSTN中的FSTN，得pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3；

S4、进行IRES序列的克隆，并连入FAD3下游，得pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES；

S5、克隆DsRed，连入IRES下游，构建质粒载体pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed；

S6、用XholI、AflII对步骤S5所得的质粒载体双酶切，电泳分离，获得三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体MAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed。

9.根据权利要求8所述的一种三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体的制备方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括如下步骤：

S11、根据“肌肉特组织特异性启动子生物信息学设计路线”优化MRF4序列，在两端添加Kpnl和Smal酶切位点及保护碱基，并将序列送至takara公司，进行人工合成；

S12、将步骤S11合成的MRF4肌肉特异启动子序列连接到PMD19T-simple载体中，挑取穿刺菌加入到LB液体培养基中37℃摇菌14-16h，通过菌液PCR检测所挑菌落是否为阳性，将阳性菌液送去测序；

S13、选择测序结果正确的菌液提取质粒，通过Kpnl和Smal双酶切回MRF4片段；

S14、通过Kpnl和Smal双酶切置换CMV。

步骤S2具体包括如下步骤：

S21、根据肌肉特异性启动子MRF4序列设计引物，并在MRF4序列两端添加EcoRl和BamHl酶切位点及保护碱基；

S22、通过PCR.扩增得到MRF4片断，

S23、将所得的MRF4片断进行测序，得片断大小为1027bp；

S24、通过EcoRl和BamHl酶切所得的MRF4片断，置换U6；

所述步骤S3具体包括如下步骤：

S31、根据本实验室设计的FAD3人源化片段序列设计引物，并在FAD3人源化片段两端添加Smal和Notl酶切位点及保护碱；

S32、通过PCR技术从构建的重组载体上获得FAD3片断；

S33、将所得FAD3片断进行测序，得片断大小1342bp；

S34、将所得的FAD3片断经Smal和Notl酶切，置换FSTN；

所述步骤S4具体包括如下步骤：

S41、设计IRES的特异性引物；

S42、通过PCR技术从构建的重组载体上获得IRES片断；

S43、将得到IRES片断进行测序，得IRES片断的大小为608bp；

S44、将IRES片断与FAD3的下游无缝连接；

所述步骤S5具体包括如下步骤：

S51、根据DsRed序列设计引物，并在DsRed两端添加Notl和Mlul酶切位点及保护碱基；

S52、通过PCR技术从重组载体上获得DsRed片断；

S53、将所得的DsRed片断进行测序，得片断大小为691bp；

S54、将所得的DsRed片断经Notl和Mlul酶切，连入IRES的下游，得质粒载体pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed；

所述步骤S6具体包括如下步骤：

S61、对鉴定正确的pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed载体在含有卡那霉素的液体LB培养基中培养并提质粒；

S62、通过XhoI和AflII对质粒载体pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收获得三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体MAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed-SV40polyA。