[发明专利]一种基于分子构象变化的测序方法

说明书

技术领域

本发明属于序列测试领域，涉及一种基于分子构象变化的测序方法，具体涉及通过纳米孔检测分子构象的变化影响通过纳米孔的离子电流进而判断出每种碱基而分析出序列。

背景技术

当前，人们通过离子电流，隧穿电流，荧光等方法来区分单个碱基，实现对序列的测量。这些方法有他们自身的优势，但是受制于信号和噪音比低和读取长度短的限制。为了克服以上限制，我们采用了一种利用石墨烯纳米孔来检测分子构象变化的测序技术。进一步利用半导体工艺集成的优势，可以将器件微型化，集成化和规模化，进一步降低最终产品的生产成本，实现快速、低成本的测序。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于分子构象变化的测序方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种基于分子构象变化的DNA测序方法，将单原子层薄膜纳米孔装置连接于电路中，将分子马达固定在纳米孔内或上方，分子马达和DNA分子模板形成合成体，再依次将含有单个碱基的溶液加入，合成体每次移动一个碱基，合成体在外电压的作用下，被拉入纳米孔，当分子马达将每一个碱基合成到DNA分子模板上时，分子马达的构象会发生变化而影响到通过纳米孔的离子电流，每个碱基造成的分子马达构象的变化不同，通过检测DNA穿越纳米孔时产生的电信号分析出DNA的序列，

所述电路包括正负电极，提供电势的电压源，检测电流变化的电流表，所述纳米孔连接在正负电极之间。

进一步，所述纳米孔的制备方法如下：

1)提供硅衬底，在硅衬底(1)上方生长厚度为0.2～1nm的单原子层薄膜(2)，接着在上下两面面生长膜厚为10～100nm的电绝缘薄膜(3)和(4)；

2)采用光刻刻蚀工艺，在电绝缘薄膜(4)和硅衬底(1)刻蚀出梯形口(5)，采用电子束光刻、反应离子刻蚀、聚焦离子束刻蚀中任一种方法穿过电绝缘薄膜(3)刻蚀出直径为1～10nm的孔(6)，采用电击穿，透射电子显微镜、氦离子束中任一种方法在单原子薄膜层(2)上刻蚀出直径为1～5nm的纳米孔(7)；

3)在孔(6)表面形成一层用于固定分子马达的化学层(8)。

进一步，步骤3)中所述修饰化学层(8)形成方法如下：通过生物素修饰法在孔(6)表面形成生物链霉素，或者通过Au-S基修饰法在孔(6)表面形成金，或者通过高分子修饰法在孔(6)表面形成氨基丙基三乙氧硅烷二戊醛。

进一步，所述分子马达固定在纳米孔内或上方方法如下：利用-SH或者-NH2修饰分子马达表面的羟基或者磷酸基以及活性基团，修饰后的分子马达表面与修饰化学层(8)的特定基团发生化学反应，从而使分子马达以共价偶联的方式固定在纳米孔内。

进一步，所述单原子层薄膜厚度为0.35nm。

进一步，所述单原子层薄膜为单层石墨烯薄膜或二硫化钼薄膜或氮化硼薄膜。

进一步，所述电绝缘薄膜为氮化硅薄膜或二氧化硅薄膜。

进一步，所述化学层采用化学自组装、化学吸附、共价键等方式固定在孔(6)表面。

进一步，所述分子马达为phi29DNA聚合酶。

所述方法也可用于检测RNA、多肽或蛋白质的序列。

本发明的有益效果在于：本发明提供一种全新的测序新方法和新思路，可以利用单原子层薄膜纳米孔快速实现DNA、RNA、多肽或蛋白质测序。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为纳米孔的制备工艺图；

图2为通过分子马达的构象变化检测序列的示意图；

图3为不同碱基时检测出的电流信号。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1纳米孔的制备：

按如图1所述的纳米孔制备工艺进行：

1)提供硅衬底，在硅衬底1上方生长厚度为0.2nm的单原子层薄膜2，接着在上下两面生长膜厚为30nm的电绝缘薄膜层3和4；

2)采用光刻刻蚀工艺，在电绝缘薄膜层4和硅衬底1刻蚀出梯形口5，采用电子束光刻在电绝缘薄膜层3刻蚀出直径为5nm的孔6，采用电击穿方法在单原子薄膜层2刻蚀出直径为3nm的纳米孔7；

3)通过生物素修饰法在孔6表面形成生物链霉素。

实施例2通过分子马达的构象变化检测序列