[发明专利]人绒毛膜促性腺激素肿瘤标志物过糖基化修饰的检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种人绒毛膜促性腺激素(hCG)肿瘤标志物过糖基化修饰(hCG-H)的检测试剂盒，特别涉及一种联合不同抗体同时对病料中hCG和hCG-H进行检测的试剂盒，属于肿瘤免疫诊断技术领域。

背景技术

肿瘤和癌症是严重威胁人类健康的主要疾病之一，早期的发现和诊断以及正确治疗手段的选用是防治肿瘤癌症疾病的关键。很多癌症患者体内某些生物分子的水平和结构会发生变化，这类分子往往可以作为发现癌症的生物标志物。这些生物标志物中相当大一部分是糖蛋白。很多疾病尤其是肿瘤的糖蛋白会发生糖链变长、分支增多、结构更加复杂等糖基化异常现象，即过糖基化。通过测定病料里的生物标志物水平可对这些疾病进行早期诊断，同时可以在治疗过程中监控生物标志物的水平来判断治疗效果，从而及时选择最有效的治疗方法。多种癌症病人，如：绒毛膜癌、侵袭性葡萄胎等，在疾病的发生过程中其hCG的含量和糖基化均会发生异常。监测hCG含量及糖链结构的变化对多种疾病的预防及早期诊断具有非常重要的意义。体外免疫诊断方法可以通过抗体特异结合的方式测定病人样本里的生物标志物水平从而早期发现和诊断肿瘤癌症疾病，现已有多种针对hCG的免疫诊断产品上市，但这些诊断产品忽略了过糖基化对诊断结果的影响，在实际应用中可能会存在以下问题：

(1)现有的免疫诊断试剂是基于标志物与抗体的结合能力不受糖基化影响的假设之上，未考虑病人hCG糖基化的个体差异。而糖基化可能会改变蛋白的结构，从而影响抗原与抗体的亲和力，最终导致测量结果发生偏差。

(2)现有的免疫诊断试剂产品只能对生物标志物hCG的蛋白总量进行定量分析，而无法从结构上区分糖基化异常的hCG-H和普通的hCG。

如果在hCG检测中能够区别正常糖基化与过糖基化的hCG，将会大大增强疾病诊断结果的准确性、灵敏度和特异性。筛选出能够识别糖基化发生变化的抗体是检测hCG过糖基化的关键，将会引导新一代的癌症诊断试剂的研究开发。

现在虽然有报道能够特异性识别hCGCore2O-糖基化异常的抗体，但是能够直接识别癌症病人hCG中N-糖基化修饰异常的抗体还未能找到，主要是由于N-糖基化修饰的微不均一性和弱免疫原性造成的。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种检测hCG过糖基化程度的检测试剂盒，本试剂盒采用亲和力受hCG的N-糖基化修饰变化影响显著和基本不受影响的抗体联用的方式同时更客观的检测hCG的蛋白总量和N-糖基化修饰程度。

发明概述

本发明通过免疫亲和纯化等手段从生殖细胞肿瘤患者的样本中分离纯化过糖基化hCG-H并用质谱技术分析其N-糖链结构。筛选亲和力受糖基化变化影响最显著的抗hCG抗体和亲和力受糖基化变化影响最小的抗体。利用筛选出的抗体通过磁微粒技术和发光标记技术制备具有商业化前景的新一代肿瘤免疫诊断试剂盒。

发明详述

一种人绒毛膜促性腺激素肿瘤标志物过糖基化修饰的检测试剂盒，包括：

包被有捕获抗体的磁珠，

所述捕获抗体为具有与抗原hCG结合受糖基化影响最小的特性的捕获抗体；

与抗原hCG结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体B，

所述与抗原hCG结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体B是具有与抗原hCG结合受糖基化影响最小的特性的检测抗体B；

与抗原hCG结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体C，

所述与抗原hCG结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体C是具有与抗原hCG结合受糖基化影响最大的特性的检测抗体C；

以及抗体稀释液、样品稀释液、洗涤液、底物液和终止液。

根据本发明优选的，所述的捕获抗体与抗原结合的抗原表位为未被糖链覆盖的区域。

根据本发明优选的，所述的与抗原结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体B与抗原结合的抗原表位为未被糖链覆盖，但不同于捕获抗体的抗原表位。

根据本发明优选的，所述的与抗原结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体C与抗原结合的抗原表位包含有能够全部或部分被糖链覆盖的区域。

本发明的另一个目的是提供上述检测人绒毛膜促性腺激素肿瘤标志物过糖基化修饰试剂盒的制备方法。

上述检测人绒毛膜促性腺激素肿瘤标志物过糖基化修饰的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

(1)包被有捕获抗体的磁珠的制备方法，步骤如下：

将2mg磁珠置于离心管中，加入pH5.0，10mM的MEST溶液500μL涡旋混匀，磁性分离，弃去上清，重复上述步骤；