[发明专利]人绒毛膜促性腺激素肿瘤标志物过糖基化修饰的检测试剂盒

权利要求书

1.一种检测人绒毛膜促性腺激素肿瘤标志物过糖基化修饰的试剂盒，其特征在于，包括：

包被有捕获抗体的磁珠，

所述捕获抗体为具有与抗原hCG结合受糖基化影响最小的特性的捕获抗体；

与抗原hCG结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体B，

所述与抗原hCG结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体B是具有与抗原hCG结合受糖基化影响最小的特性的检测抗体B；

与抗原hCG结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体C，

所述与抗原hCG结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体C是具有与抗原hCG结合受糖基化影响最大的特性的检测抗体C；

以及抗体稀释液、样品稀释液、洗涤液、底物液和终止液。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的捕获抗体与抗原结合的抗原表位为未被糖链覆盖的区域。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的与抗原结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体B与抗原结合的抗原表位为未被糖链覆盖，但不同于捕获抗体的抗原表位。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的与抗原结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体C与抗原结合的抗原表位包含有能够全部或部分被糖链覆盖的区域。

5.权利要求1所述检测人绒毛膜促性腺激素肿瘤标志物过糖基化修饰的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)包被有捕获抗体的磁珠的制备方法，步骤如下：

将2mg磁珠置于离心管中，加入pH5.0，10mM的MEST溶液500μL涡旋混匀。将离心管放置于磁分离架上直到磁珠完全被吸附，弃去上清。重复两次。用500μLMEST溶液重悬，加入2.5mg的EDC和NHS，涡旋混匀，于室温下活化30min，弃上清。用MEST洗涤三次。用pH8.0的50mM磷酸盐缓冲溶液洗涤磁珠两次。取150μg抗体MCA-A，用pH8.0的50mM磷酸盐缓冲溶液配置成0.3mg/mL的溶液加入到磁珠中，室温反应3h。完毕后将离心管置于磁分离架上磁性分离，弃上清。加入1％BSA溶液500μL室温下封闭30min，完毕后将离心管置于磁分离架上磁性分离，弃上清。用pH8.0的50mM磷酸盐缓冲溶液洗涤三次并重悬至lμg/mL，并于4℃保存备用。

(2)与hCG结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体的制备方法，步骤如下：

分别取1mg抗体MCA-B和抗体MCA-C，加入10mg/mL的偶联剂2-IT溶液，室温静置20min，加入0.1mol/L甘氨酸溶液10μL，室温静置5min，除盐后，收集活化的抗体。取1.5mgALP，加入5mg/mL的交联剂SMCC溶液，室温静置30min，除盐，收集活化的ALP。将活化的抗体和活化的ALP混合，4℃静置过夜，用Supperdex-200凝胶纯化柱纯化得到ALP标记的抗体溶液，用PBS重悬至lμg/mL，于4℃保存备用。

(3)按现有技术配制抗体稀释液、样品稀释液、洗涤液、底物溶液和终止液，然后包装后，即得检测人绒毛膜促性腺激素肿瘤标志物过糖基化修饰的检测试剂盒。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)和(2)中捕获抗体和检测抗体采用如下方法筛选：

A、制备抗原并鉴定：收集病料(病人尿液)利用免疫亲和层析技术从该样品溶液中分离纯化过糖基化hCG-H作为抗原。用N-glycanase(PNGaseF)对抗原进行去糖基化处理，用PGC小柱收集酶切下来的糖链，采用液质联用方法对N-糖链进行分析。同时对hCG进行同步处理作为正常糖基化的对照。

B、筛选不同用途的抗体并验证：通过生物膜光干涉技术(BLI)从十几种商品化的单克隆抗体中筛选出3种抗体，其中抗体A(MCA-A)和抗体B(MCA-B)的亲和力基本不受hCG的N-糖基化影响，抗体C(MCA-C)与hCG-H的结合力相比hCG明显降低。因此以抗体A作为捕获抗体，抗体B和抗体C作为检测抗体。