[发明专利]一种高效提取食用菌菌丝体营养生长阶段RNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学工程技术领域，具体涉及一种高效提取食用菌菌丝体营养生长阶段RNA的方法。

技术背景

食用菌不仅物美味鲜，而且低能量、低脂肪，并富含蛋白质、膳食纤维和维生素等营养素，正在发展成为继植物性食品、动物性食品之外的第三类食品，即菌物性食品。此外，食用菌还是功能性多糖、萜类化合物等多种天然产物的来源之一，在提高人体免疫功能，防治多种慢性病和抗衰老等方面具有显著的功效。因此，食用菌越来越受到广大消费者的青睐，市场需求量不断增大。常见的食用菌栽培基质主要由富含纤维素、木质素的固形物(木屑、棉籽壳、作物秸秆、中药渣)加入适量的辅料(麸皮或米糠)再与水配制而成。

近年来，尽管食用菌产业在我国发展迅速，国家对食用菌产业支持力度也逐年加大，但基础研究薄弱的现状还没有得到根本性的改变。传统的研究手段已经无法满足当前食用菌相关研究的需求。而分子生物学技术可以突破传统研究方法的限制，将极大地促进食用菌木质纤维素降解的分子机制、食用菌子实体形成发育的调控机理、食用菌环境因子响应的分子机制、食用菌活性物质及其合成代谢的分子基础、食用菌遗传多样性分析及食用菌鉴定与育种等领域的研究，而所有这些研究的基础便是从食用菌菌丝体中获取高质量的RNA。

常规的实验手段是从液体培养基中的菌丝体、PDA培养基表面的菌丝体或者食用菌的子实体中提取RNA，这些提取方法已经比较成熟。然而，食用菌在栽培基质(木屑、棉籽壳、作物秸秆、中药渣)上的生长分为两个阶段：即菌丝体营养生长阶段和子实体生长阶段，而菌丝体营养生长阶段是整个食用菌生长发育过程中最重要的阶段。由于在菌丝体营养生长阶段，菌丝体和栽培基质紧密嵌合，无法将菌丝体从栽培基质上分离，造成了RNA提取困难、质量差，影响扩增。食用菌营养生长阶段RNA提取方法的缺失，导致整个食用菌生长发育过程中分子机制数据链条的不完整，影响了研究的深入开展。因此建立高效、可靠的食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取方法就显得尤为重要。

目前，从液体培养基中的菌丝体、PDA培养基表面的菌丝体或者食用菌的子实体中提取RNA的方法已有很多报道(Castanera R,Pérez G,Omarini A,et al.Transcriptional and enzymatic profiling of Pleurotus ostreatus laccase genes in submerged and solid～state fermentation cultures[J].Applied and environmental microbiology,2012,78(11):4037～4045.，Abdelazim A M,Afifi1&2M.Oyster mushroom(Pleurotus ostreatus)strain 238ameliorates the oxidative stress in STZ～induced diabetic mice[J].Life Science Journal,2013,10(3).，税丕容,郑晓冰,林俊芳,等.简便高质量的食用茵总RNA提取方法[J].食用菌学报,2008,15(1):32～41.)。但是有关菌丝体营养生长阶段，菌丝体和栽培基质紧密混合状态下提取RNA的方法还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法。该方法可以有效去除培养基质对RNA提取过程的干扰，具有RNA提取效率高、纯度高、不含PCR酶抑制剂等优点。

术语说明：

rpm：每分钟的转数，(revolutions per minute转数/分)

技术方案如下：

一种用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法，包括前处理阶段和提取阶段，其特征在于，前处理阶段包括下列步骤：

1)取一份布满菌丝体的培养基，粗研，置一洁净容器中；

2)加入适量的缓冲液I，至淹没过布满菌丝体的培养基，放置于恒温摇床，保持温度35～40℃，摇床转速100～150rpm摇动2～3h；

3)取步骤2)的溶液，3000～4000rpm低速离心10～15min；溶液分成沉淀和上清液，收集上清液；

4)步骤3)中剩余的沉淀，加入缓冲液II洗涤，3000～4000rpm低速离心10～15min，洗涤过程重复2～5次，取每次洗涤后的上清液合并；