[发明专利]一种高效提取食用菌菌丝体营养生长阶段RNA的方法

权利要求书

1.一种用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法，包括前处理阶段和提取阶段，其特征在于，前处理阶段包括下列步骤：

1)取一份布满菌丝体的培养基，粗研，置一洁净容器中；

2)加入适量的缓冲液I，至淹没过布满菌丝体的培养基，放置摇床，保持温度35～40℃，摇床转速100～150rpm摇动2～3h；缓冲液I：20mg/mL溶菌酶500μL+20mg/mL蛋白酶K 200μL+0.02～0.1mmol/LpH 5.5～6.5PBS缓冲液配制成1000ml溶液；

3)取步骤2)的溶液，3000～4000rpm低速离心10～15min；溶液分成沉淀和上清液，收集上清液；

4)步骤3)中剩余的沉淀，加入缓冲液II洗涤，3000～4000rpm低速离心10～15min，洗涤过程重复2～5次，取每次洗涤后的上清液合并；缓冲液II：1mmol EDTA+10％SDS 10ml+0.02～0.1mmol pH 5.5～6.5PBS缓冲液配制成100ml 溶液；EDTA为乙二胺四乙酸；SDS为十二烷基磺酸钠；

5)将步骤3)和步骤4)离心的上清液集中到一起，在转速10000～12000rpm，4℃离心10～15min，弃上清液，收集沉淀。

2.如权利要求1所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法，其特征在于，步骤2)中缓冲液I的加入量为：缓冲液I与培养基的体积范围为(1.5∶1)～(4.0∶1)。

3.如权利要求1所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法，其特征在于，步骤4)中缓冲液II的加入量与培养基的体积比为(1：3)～(1.5：1)。

4.如权利要求1～3任一项所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法，其特征在于，提取阶段包括下列步骤：

1)加入TRIzol试剂，混匀；

2)10000～15000r/min,2～8℃，离心5～20min；

3)取上清，加入酚和氯仿混合液，摇匀4～10min，静置4～10min；

4)10000～15000r/min,2～8℃，离心5～20min；

5)取上清液，加入异丙醇，摇匀2～5min，放置～20℃冰箱中，静置20～60min；

6)10000～15000r/min,2～8℃，离心5～20min；

7)舍去上清液，留沉淀，加入乙醇冲洗；

8)10000～15000r/min,2～8℃，离心5～20min；

9)弃上清液，将其放入超净工作台，风干5～30min；

10)加入贮存液I，30～40℃作用10～20min，进一步采用RNA纯化试剂盒纯化RNA；贮存液I：1.2mL DEPC处理水+1mmol BSA+DNase I(RNase free)30U+RNase抑制剂40U配制成100ml溶液；DEPC处理水：无菌蒸馏水中加入0.1％(v/v)焦碳酸二乙酯(DEPC)，室温搅拌4小时以上，121度高压灭菌20分钟，冷却备用；

11)-40～-20℃冰箱中保存。

5.如权利要求4所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法，其特征在于，步骤1)中，加入0.1～2ml TRIzol试剂。

6.如权利要求4所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法，其特征在于，步骤3)中，取600μl上清，加入500～800μl酚和氯仿混合液，摇匀4～8min，静置4～8min；酚∶氯仿体积比20～30∶20～28。

7.如权利要求6所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法，其特征在于，步骤3)中，，加入600μl酚和氯仿混合液，酚∶氯仿∶异戊醇体积比25∶24。

8.如权利要求4所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法，其特征在于，步骤5)中，取600μl上清液，加入500～800μl异丙醇，摇匀2～4min，放置～20℃冰箱中，静置20～40min。

9.如权利要求8所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段RNA提取的方法，其特征在于，步骤5)中，取600μl上清液，加入600μl异丙醇，摇匀3min，放置-20℃冰箱中，静置30min。