[发明专利]一种高效提取食用菌菌丝体营养生长阶段DNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学工程技术领域，具体涉及一种高效提取食用菌菌丝体营养生长阶段DNA的方法。

技术背景

食用菌不仅物美味鲜，而且低能量、低脂肪，并富含蛋白质、膳食纤维和维生素等营养素，正在发展成为继植物性食品、动物性食品之外的第三类食品，即菌物性食品。此外，食用菌还是功能性多糖、萜类化合物等多种天然产物的来源之一，在提高人体免疫功能，防治多种慢性病和抗衰老等方面具有显著的功效。因此，食用菌越来越受到广大消费者的青睐，市场需求量不断增大。常见的食用菌固体培养基一般是在富含纤维素、木质素的固形物(木屑、棉籽壳、作物秸秆)中加入适量的辅助营养料(麸皮或米糠)再与水配制而成。

近年来，尽管食用菌产业在我国发展迅速，国家对食用菌产业支持力度也逐年加大，但基础研究薄弱的现状还没有得到根本性的改变。传统的研究手段已经无法满足当前食用菌相关研究的需求。而分子生物学技术可以突破传统研究方法的限制，将极大地促进食用菌DNA分子标记、食用菌生长发育的调控机理、食用菌环境因子响应的分子机制、食用菌活性物质及其合成代谢的分子基础、食用菌遗传多样性分析及食用菌菌种鉴定与育种等领域的研究，而所有这些研究的基础便是将菌丝体中的遗传物质DNA分子高质量的提取出来。

常规的实验手段是从液体培养基中的菌丝体、PDA培养基表面的菌丝体或者食用菌的子实体中提取DNA，这些提取方法已经比较成熟。然而，食用菌在栽培基质(木屑、棉籽壳、作物秸秆、中药渣)上的生长分为两个阶段：即菌丝体营养生长阶段和子实体生长阶段，其中菌丝体营养生长阶段是整个食用菌生长发育过程中最为重要的阶段。在营养生长阶段，菌丝体和栽培基质紧密嵌合，无法将菌丝体从栽培基质上有效分离，造成了DNA提取困难、质量差，影响后续扩增。食用菌营养生长阶段DNA提取方法的缺失，导致整个食用菌生长发育过程中分子机制研究的数据链条不完整，影响了研究的深入开展。因此建立高效、可靠的食用菌菌丝体营养生长阶段DNA提取方法就显得尤为重要。

目前，从液体培养基中的菌丝体、PDA培养基表面的菌丝体或者食用菌的子实体中提取DNA的方法已有很多报道(如：Zhang Y J,Zhang S,Liu X Z,et al.A simple method of genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk fungal strains[J].Letters in applied microbiology,2010,51(1):114-118.，藏金平,连宾,袁生.简便易行的食用菌菌丝体基因组DNA提取法[J].食品科学,2005,26(3):66-68.，唐良华,苏敏,郑丹华,等.食用菌总DNA提取方法的研究[J].福建轻纺,2006(1):1-4.)。但是有关菌丝体营养生长阶段，菌丝体和栽培基质紧密混合状态下提取DNA的方法还很少研究。仅见国家食用菌工程技术研究中心的余昌霞等人提取香菇和金针菇营养生长阶段的DNA用于生物量测定的报道(余昌霞,曹晖,陈明杰,等.香菇135菌丝生物量及其DNA含量标准曲线的构建[J].食用菌学报,2010,17(3):1-7.，余昌霞,曹晖,陈明杰,等.金针菇菌丝生物量与其DNA含量标准曲线的构建[J].食用菌学报,2013,20(3):6-9.)。由于其目的是为了表征生物量，并不要求DNA的质量及后续扩增，因此其所用方法和常规的菌丝体提取方法相同，并未做任何改进。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于食用菌菌丝体营养生长阶段DNA提取的方法。该方法可以有效去除培养基质对DNA提取过程的干扰，具有DNA提取效率高、纯度高、不含PCR Taq酶抑制剂等优点。

术语说明：

rpm：每分钟的转数，(revolutions per minute转数/分)。

PCR Taq酶抑制剂：许多离子表面活性剂在极低浓度下几乎可完全抑制Taq酶的活性如脱氧胆胺酸钠(0.06％)，十二烷基肌氨酸钠(0.02％)，十二烷基硫酸钠(0.01％)，这类物质称为PCR Taq酶抑制剂。

技术方案如下：

一种用于食用菌菌丝体营养生长阶段DNA提取的方法，包括前处理阶段和提取阶段，其特征在于，前处理阶段包括下列步骤：

1)取一份布满菌丝体的培养基，粗研，置一洁净容器中；

2)加入缓冲液I，至淹没过布满菌丝体的培养基，置于恒温摇床，保持温度35～40℃，摇床转速100～150rpm反应2～3h；