[发明专利]一种高效提取食用菌菌丝体营养生长阶段DNA的方法

权利要求书

1.一种用于食用菌菌丝体营养生长阶段DNA提取的方法，包括前处理阶段和提取阶段，其特征在于，前处理阶段包括下列步骤：

1)取一份布满菌丝体的培养基，粗研，置一洁净容器中；

2)加入缓冲液I，至淹没过布满菌丝体的培养基，放置于摇床上，保持温度35℃～40℃，摇床转速100～150rpm摇动2～3h；缓冲液I：20mg/mL溶菌酶500μL+20mg/mL蛋白酶K 200μL+0.02～0.1mmol/L pH 6.0～7.0PBS缓冲液配制成1000mL溶液；

3)取步骤2)的溶液，3000～4000rpm低速离心10～15min，溶液分成沉淀和上清液；收集上清液；

4)步骤3)中剩余的沉淀，加入缓冲液II洗涤，3000～4000rpm低速离心10～15min，取上清；洗涤过程重复2～5次，取每次洗涤后的上清液合并；缓冲液II：1mmol EDTA+10％SDS 10mL+0.02～0.1mmol/L pH 6.0～7.0PBS缓冲液配制成100mL溶液；EDTA为乙二胺四乙酸；SDS为十二烷基磺酸钠；

5)将步骤3)和步骤4)离心的上清液集中到一起，在转速10000～12000rpm，4℃离心10-15min；弃上清液，收集沉淀。

2.如权利要求1所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段DNA提取的方法，其特征在于，步骤2)中缓冲液I与培养基的体积比为(1.5：1)～(4：1)。

3.如权利要求1所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段DNA提取的方法，其特征在于，步骤4)中缓冲液II与培养基的体积比为(1：3)～(1.5：1)。

4.如权利要求1～3任一项所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段DNA提取的方法，其特征在于，提取阶段包括下列步骤：

1)弃上清液，加入贮存液I；贮存液I：1mmol EDTA+10mmolTris-Hcl配制成100mL溶液；EDTA为乙二胺四乙酸；Tris-Hcl为三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液；

2)放入30～45℃恒温水浴，保持0.5～2h；

3)加入贮存液II，置30～45℃恒温水浴中，保持0.5～2h；贮存液II：20mg/mL蛋白酶K 20μL+10％SDS 10mL配制成100mL溶液；SDS为十二烷基磺酸钠；

4)加入贮存液III，混匀；贮存液III：5mol NaCl+0.1％CTAB 10mL配制成100mL溶液；CTAB为十六烷基三甲基溴化铵；

5)加入高盐CTAB溶液，混匀；

6)50～60℃水浴80～100min；

7)加入酚/氯仿/异戊醇的混合溶液；8字混匀，5～20min；

8)10000～15000rpm，2～8℃离心5～20min；

9)取上清液，加入氯仿/异戊醇的混合液，8字混匀；

10)10000～15000rpm，2～8℃离心5～20min；

11)取上清液，加入700～900μL异丙醇，8字混匀；

12)10000～15000rpm，室温离心5～20min，弃上清液；

13)用乙醇吹洗2～5遍；

14)10000～15000rpm，室温离心2～8min；

15)弃上清液，晾干，加入贮存液I；

16)2～6℃冰箱中，溶解一夜；

17)-40～-10℃冰箱中保存。

5.如权利要求4所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段DNA提取的方法，其特征在于，贮存液I、贮存液II、贮存液III的体积比为(8～15)：1：(1.5～3)。

6.如权利要求4所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段DNA提取的方法，其特征在于，贮存液I、贮存液II、贮存液III的体积比为(10～13)：1：(1.7～2.5)。

7.如权利要求5～6任一项所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段DNA提取的方法，其特征在于，步骤5)中，加入60～100μL高盐CTAB溶液，混匀；步骤6)中，55℃水浴90min。

8.如权利要求5～6任一项所述的用于食用菌菌丝体营养生长阶段DNA提取的方法，其特征在于，步骤7)中，加入700～900μL酚/氯仿/异戊醇混合液；8字混匀，10min；酚∶氯仿∶异戊醇体积比(20～30)：(20～28)：1。