[发明专利]一种单染色分离方法、单染色体高通量测序文库的构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及高通量测序领域，具体涉及一种单染色分离方法、单染色体高通量测序文库的构建方法及应用。

背景技术

人类基因组分析工作已经从确定所有人的“平均”参考序列(referencesequence)快速进入个体基因组测序时代。目前单细胞已经成为科学家们关注的重点，但是对于单个染色体的研究还是一个很空白的领域。人体内的每一个细胞里都含有两套基因组，其中一套来自父亲，另外一套来自母亲，这就叫做单体型现象，而每一个单倍体基因组(haploidgenome)中的变异都会对基因的表达、蛋白质的功能，以及疾病造成非常大的影响。

目前对于单细胞测序都是较为困难的，从单细胞里分离到单个的染色体，并在皮克范围内进行微量的建库，这都是目前行业的难点及关注点。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种单染色分离方法、单染色体高通量测序文库的构建方法及应用。

第一方面，本发明提供了一种单染色分离方法，包括如下步骤：

S01)模拟实验

采用随机数产生方法建模，获得验证实验总共所需要的稀释容器的最佳数目，包括如下步骤：

a)待分析物种染色体数记为X，并分别编号为S_n，n＝1～X，n和X为自然数；

b)在1-Z个数中随机产生X个数；将X个数分别对应为染色体编号，每个S_n各对应X个数中的一个数值；将Z个数均等分布在N个稀释容器中，其中Z、X为自然数，Z不小于X；重复步骤b)T次；

c)计算步骤b)T次模拟实验中，每次模拟实验后各稀释容器中对应的数字，记录为对应染色体的种类和数量；

d)将所有模拟实验步骤c)所得的数据进行统计学分析，获得如下PHC、及P1～P3四个参数：1)处于同一个稀释容器中的同源染色体的数量，记为PHC；2)将所有同源染色体完全分开的实验的频率，记为P1；3)只含有1条染色体的稀释容器的频率，记为P2；4)完全不含染色体的稀释容器的频率，记为P3；综合四个参数评估出总共所需要的稀释容器的最佳数目Q，其中，Q为不大于N的自然数。

S02)进行验证实验

获得待分析物种分裂中期至中后期的单细胞，取全部染色体，采用梯度稀释法将全部染色体稀释到Q个稀释容器中，获得至少有1个为仅含有单染色体的稀释容器。

优选地，所述步骤S01)中的步骤a)中，待分析物种为人，X为46。

优选地，所述步骤S01)中的步骤b)中，所述的将Z个数均等分布在N个稀释容器中的步骤包括：将Z个数从大到小排列，每隔Z/N个数取一次数值对应一个稀释容器。比如，Z为10，N为5，则每隔2个数取1次数值对应一个稀释容器：即，数字1和2分布到第1个稀释容器中，数字3和4分布到第2个稀释容器中，数字5和6分布到第3个稀释容器中，依次类推。

优选地，所述步骤S01)中的步骤b)之前还包括：确定Z和T值。

进一步优选地，确定Z和T值的步骤包括：

统计步骤b)中如下PHC、P1～P3四个参数：1)处于同一个稀释容器中的同源染色体的数量，记为PHC；2)将所有同源染色体完全分开的实验的频率，记为P1；3)只含有1条染色体的稀释容器的频率，记为P2；4)完全不含染色体的稀释容器的频率，记为P3；取各参数均趋于稳定时最小的Z’和T’值，即为合理的Z和T值。

T值即：步骤S01)中，共需要重复步骤b)(随机分管过程)多少次比较合理，T优选为20000。Z值即：步骤S01)的步骤b)中，X被稀释多少倍(将X稀释在Z个数中)比较合理。

优选地，所述步骤S01)中的步骤b)中，Z为2ⁿ(n＝6～16)，优选为1024。

优选地，所述步骤S01)中的步骤b)中，N为4-256中任一自然数(N优选为4的倍数)。

优选地，所述步骤S01)中的步骤d)中，综合四个参数，得出总共所需要的稀释容器的最佳数目Q(优选为24)的标准为：P2尽可能大；且取P1和P3尽可能小。

优选地，所述步骤S02)中，梯度稀释法对染色体进行稀释的步骤包括：

1)将Q或者R进行因式分解，得Y＝y*2ⁿ，其中，Y＝R或Q，n为自然数，R＝Q±2k，k、R为自然数；

2)取1个稀释容器，在稀释容器中先后加入细胞裂解液和1个单细胞，孵育，得细胞悬液，总体积为V₁；