[发明专利]一种香草扁桃酸免疫检测试剂及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及香草扁桃酸免疫原、抗香草扁桃酸特异性抗体和香草扁桃酸检测试剂。

背景技术

香草扁桃酸（VanillymandelicAcid，VMA），其结构式如式（Ⅱ）所示：

式（Ⅱ）

香草扁桃酸又称为3-甲氧基-4-羟基苦杏仁酸（DL-3-Methoxy-4-hydroxymandelicacid，MHMA）或香草苦杏仁酸，是肾上腺髓质激素儿茶酚胺（CA）类物质的终末代谢产物，CA几乎全部在体内代谢，少部分的CA经单胺氧化酶作用，生成对-二羟杏仁酸，大部分CA在CA-O-甲基转移酶作用下转变为3-甲氧肾上腺素或去甲氧肾上腺素，最终代谢为3-甲氧基-4-羟基苦杏仁酸。体内的CA代谢非常迅速，其代谢产物多由尿液排出。临床上24h尿中VMA的含量升高见于嗜铬细胞瘤、神经母细胞瘤、原发性高血压、心肌梗塞、慢性肾功能不全、甲状腺机能亢进或减退、肾上腺皮质功能不全、交感神经生理功能异常等。因此，测定24h尿中VMA的排出量对于上述疾病的临床诊断具有重要意义。

经典的VMA检测方法主要有：可见光分光光度法，此方法操作过程繁琐，精确度差；气象色谱法，此法对仪器要求比较高，操作复杂；高相液相-电化学法，此方法易受仪器质量和工作环境的干扰，测定的灵敏度和专一性均需进一步提升；重氮法，此方法操作繁琐、可靠性低，回收率、重复性、稳定性还有待提高。以上测定方法都不能适应VMA临床检验的需要，目前市场上缺乏稳定性好、灵敏度高、特异性强的VMA检测试剂，尤其是质量好的自动化检验试剂。因此，研发一种质量达到临床检验要求、实用性强、性价比高，可应用于全自动生化分析仪的VMA检测试剂势在必行。

发明内容

本发明为了克服现有技术存在的缺陷，采用独特的香草扁桃酸制备免疫原性强的香草扁桃酸免疫原及其抗体，用该抗体制备的香草扁桃酸均相酶免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对香草扁桃酸高通量、快速化的检测。该检测试剂具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低香草扁桃酸检测成本，有利于临床推广使用。

本发明的一个目的在于提供一种免疫原性强的香草扁桃酸免疫原。

本发明的另一个目的在于提供一种香草扁桃酸免疫原的制备方法。

本发明的又一个目的在于提供使用本发明香草扁桃酸免疫原制备得到的特异性强的抗香草扁桃酸特异性抗体。

本发明的再一个目的在于提供一种香草扁桃酸检测试剂及其制备方法。

本发明的香草扁桃酸免疫原，免疫原性高，可以诱导得到高效价的抗香草扁桃酸特异性抗体。该抗体特异性高，与香草扁桃酸的结合力强。由该抗体制备得到的香草扁桃酸检测试剂，可以快速、准确地确定样品中的香草扁桃酸含量。本发明是通过以下技术方案实现的：

一种香草扁桃酸免疫原，其结构式如式（Ⅰ）所示：

式（Ⅰ）

载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽，优选为血清蛋白、血蓝蛋白和甲状腺球蛋白，更优选为血清白蛋白，进一步优选为牛血清白蛋白。

所述的香草扁桃酸免疫原由香草扁桃酸与上述载体连接而成，香草扁桃酸的化学结构如式（Ⅱ）所示：

式（Ⅱ）

该香草扁桃酸免疫原的具体合成途径和方法如下：

（1）将载体蛋白100～300mg溶解于25～75ml0.2M，pH8.5的磷酸缓冲液中；

（2）将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：100～300mg香草扁桃酸、1.75～5.25ml二甲基甲酰胺、1.75～5.25ml乙醇、3.5～10.5ml10mM，pH5.0的磷酸钾缓冲液、100～300mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、25～75mgN-羟基硫代琥珀酰亚胺，将这些化学品在室温下搅拌溶解反应30～60min；

（3）将溶解好的溶液滴加至载体蛋白溶液中，并在2～8℃下搅拌过夜，得到抗原；将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到香草扁桃酸免疫原。

一种抗香草扁桃酸特异性抗体，由上述的香草扁桃酸免疫原免疫动物后生产得到。

所述的抗香草扁桃酸特异性抗体由上述制得的香草扁桃酸免疫原采用常规方法接种实验动物，加强免疫后取抗血清，具体步骤如下：

（1）用PBS将上述合成的BSA-香草扁桃酸免疫原稀释至0.1～3.0mg/ml，得到抗原溶液，然后用0.5～5.0ml抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；