[发明专利]一种香草扁桃酸免疫检测试剂及其制备方法

权利要求书

1.一种香草扁桃酸免疫原，其结构式如式（Ⅰ）所示：

式（Ⅰ）

载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽，选自血清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白中的一种，优选为血清蛋白，更优选为牛血清白蛋白。

2.一种如权利要求1所述的香草扁桃酸免疫原的制备方法，其特征在于包含以下步骤：

（1）将载体蛋白100～300g溶解于25～75ml0.2M，pH8.5的磷酸缓冲液中；

（2）将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：100～300mg香草扁桃酸、1.75～5.25ml二甲基甲酰胺、1.75～5.25ml乙醇、3.5～10.5ml10mM，pH5.0的磷酸钾缓冲液、100～300mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、25～75mgN-羟基硫代琥珀酰亚胺，将上述化学品在室温下搅拌溶解反应30～60min；

（3）将溶解好的溶液滴加至载体蛋白溶液中，并在2～8℃下搅拌过夜，得到抗原；将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到香草扁桃酸免疫原。

3.一种抗香草扁桃酸特异性抗体，由权利要求1-2任意一项所述的香草扁桃酸免疫原免疫实验动物后产生的完整抗体分子，或者为保留与香草扁桃酸特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物。

4.根据权利要求3所述的一种抗香草扁桃酸特异性抗体，其特征在于所述的完整的抗体分子、抗体片段或抗体衍生物，为采用单一的香草扁桃酸免疫原对动物加强免疫所获得的多克隆抗体，或者为免疫后经体细胞杂交获得的单克隆抗体；所述的实验动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马的一种，优选为兔。

5.一种如权利要求3-4中任一项所述的抗香草扁桃酸特异性抗体的制备方法，其特征在于包含以下步骤：

（1）用PBS将香草扁桃酸免疫原稀释至0.1～3.0mg/ml，得到抗原溶液，然后用0.5～5.0ml抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；

（2）2～3周后，再用0.5～5.0ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂对上述实验动物注射一次，之后每隔四周注射一次，共计注射3～6次；

（3）对步骤（2）的实验动物取血，分离纯化得到效价为1:30000～1:50000的抗香草扁桃酸特异性抗体。

6.一种香草扁桃酸检测试剂，含有权利要求3-5所述的抗香草扁桃酸特异性抗体和指示试剂，所述的指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂或发光试剂中的一种，优选为酶试剂；所述的酶试剂由香草扁桃酸酶标偶联物和酶的底物组成，酶标偶联物优选为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物，酶的底物优选为葡萄糖-6-磷酸。

7.一种如权利要求6所述的香草扁桃酸检测试剂的制备方法，其特征在于包含以下步骤：

（1）试剂A：将2.018～8.072g、5.625～22.50mM氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和0.856～3.422g、5.625～22.50mM葡萄糖-6-磷酸用0.5～2L55mM、pH=8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；将权利要求4-6中任一项所述的抗香草扁桃酸特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗香草扁桃酸特异性抗体与均相酶底物的体积比为1:100～1:10000；

（2）试剂B：将香草扁桃酸酶标偶联物加到120mM、pH=8.2的Tris缓冲液中，香草扁桃酸酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:100～1:10000；

所述的抗香草扁桃酸特异性抗体与均相酶底物的体积比优选为1:1000；

所述的香草扁桃酸酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比优选为1:3000。

8.根据权利要求6-7任一项所述的香草扁桃酸检测试剂，其特征在于所述的香草扁桃酸酶标偶联物的制备方法包含以下步骤：

（1）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液的制备：称取7.5～22.5mg规格为100KU的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温溶解于6～18mL含有72.6mg0.05MTris、8mg3.3mMMgCl₂和100mgNaCl的溶液中，pH=9.0；在溶液中加入112.5～337.5mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、67.5～202.5mg葡萄糖-6-磷酸以及0.375～1.125mL卡必醇；再逐滴加入1～3mL二甲基亚砜；

（2）香草扁桃酸的激活：在无水状态下称取5～15mg香草扁桃酸，溶解于300～900μL二甲基甲酰胺中；使上述溶液温度降到-2~-8℃；加入1.5～4.5μL三丁胺；加入0.75～2.25μL氯甲酸异丁酯；-2~-8℃搅拌30～60分钟；

（3）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与香草扁桃酸的连接：将步骤（2）激活的香草扁桃酸溶液逐滴加入到步骤（1）溶解的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中；2-8℃搅拌过夜；

（4）纯化产物：通过G-25凝胶层析柱纯化连接产物，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物，于2-8℃下储存。