[发明专利]一种磁性固定化芽胞漆酶及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种磁性固定化芽胞漆酶及其制备方法与应用，属于固定化技术领域和废水处理领域。本发明公开的固定化芽胞漆酶以Fe₃O₄磁性纳米粒子为载体，通过双功能交联剂将磁性纳米粒子直接固定在芽胞表面；其可通过外加磁场进行快速分离，并反复使用。本发明公布的磁性芽胞漆酶制备方法不需要对磁性纳米粒子进行表面修饰，其过程仅包含芽胞的制备、固定化处理和收集三个步骤，大大降低了制备过程的操作要求，还大大节约了固定化芽胞漆酶的制备成本。本发明提供的磁性固定化芽胞漆酶可直接用于染料的脱色处理，并保持较高的脱色效率。

技术领域

本发明涉及一种固定化芽胞漆酶及其制备与应用，属于固定化技术领域和废水处理领域。

背景技术

漆酶(laccase)是一种含铜多酚氧化酶，广泛分布于真菌、细菌、植物和昆虫之中。漆酶可以氧化酚类物质，在介体的辅助作用下，还可以氧化非酚类物质，在染料脱色、饮料处理，制浆漂白以及生物传感器开发中都有研究和应用。芽胞漆酶是指固着在芽胞外衣上的漆酶，是最具代表性的细菌漆酶，其以芽胞作为研究单位，具有耐碱性耐高温的特点，在纺织染料脱色应用中具有明显优势。

近年来对于芽胞漆酶的研究仍处在生化特性描述和简单的染料脱色应用研究上，极少有芽胞漆酶固定化的报道。对酶进行固定化通常可以提高酶的稳定性、易于酶的分离，而且可以提高酶的重复使用率，降低工业化应用的成本。在众多的固定化载体中，磁性纳米粒子是一类非常独特的材料。磁性纳米粒子的直径和重量都极小，且具有超顺磁性，这使得其在使用过程中分散均匀，在使用结束后极易被分离出来。磁性固定化的实施方案非常多，纳米粒子的种类，表面修饰与否，修饰基团类型，固定化的条件等等都会影响酶的固定化效率以及固定化酶的最终使用性能。选择一种经济、简便而且高效的方案在工业化应用中极为重要。

发明内容

本发明旨在提供一种简便可行的芽胞固定化方法，以此方法制备得到可重复利用的固定化芽胞漆酶，并应用于染料脱色。

所述固定化芽胞漆酶通过以下步骤来制备：

(1)制备芽胞杆菌属菌株所产的芽胞；

(2)固定：称取0.1g Fe₃O₄磁性纳米粒子(粒径为5－30nm)，加入到5－15ml 0.02MNa₂HPO₄－NaH₂PO₄缓冲液(pH 7,其中含0.1M NaCl)，加入0.5－2.0ml碳二亚胺盐酸盐(4mg/ml)，超声处理10min，接着加入0.1－1.0ml芽胞(100mg/ml，湿重)，超声处理30min，然后置于50－250rpm，4－40℃条件下旋转振荡20－240min；

(3)回收：将完成固定化的混合液通过磁铁吸附进行分离，用缓冲液冲洗1－5次，分别收集上清液和固定化芽胞，保藏于0－40℃。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述的芽胞制备包括以下步骤：

①将产漆酶的芽胞杆菌属菌株在37℃条件下在生孢培养基上培养2d；

②以8000rpm的离心速度对上述培养物进行10min的离心，收集芽胞；

③水洗芽胞1次；

④水洗所得的的芽胞加入溶菌酶使其终浓度为1mg/ml，在37℃条件下保温2h。

⑤培养物经溶菌酶处理后，先后经1M NaCl和1M KCl洗，8000rpm离心10min收集芽胞。

⑥对芽胞进行湿重称量，用去离子水重悬芽胞，浓度为100mg/ml。

其中，所述的芽胞产生菌株包括但不限于Bacillus pumilus W3。