[发明专利]一种脱落细胞DNA低频突变富集测序方法

说明书

技术领域

本发明属于生物信息学高通量测序技术领域，具体涉及一种脱落细胞DNA低频突变富集测序方法。

背景技术

脱落细胞是指自然管腔器官内表面粘膜正常情况下，人体器官粘膜上皮细胞经常有脱落更新，一般分为3大类：鼻咽部、口腔、食肠管、阴道等的自然脱落细胞以及部分人工刷洗所得细胞；体腔抽出液(胸腔积液，脑脊液，心包腔积液等)；针吸细胞。由于其具有安全性，设备操作简便性，以及基于其组织病理特性，逐渐发展出一门新兴学科，脱落细胞病理学，广泛应用于相关肿瘤早筛检测诊断中。但传统检测存在一定的误诊率，约有10-40％假阴性，主要原因一方面是由于细胞学检查局限性，只看单个或一小堆细胞，不能全面观察病变组织结构。另一方面脱落细胞学诊断难度较大，需要有经验的医生复验。遇到可疑或无把握病例应重复取材，需仔细观察。此外整体的传统临床检测诊断过程依然费时，费力，急需要一种更高精准实用性的检测手段。

目前随着分子生物学以及测序技术的飞速发展，基于高通量测序技术的脱落细胞检测正逐步走入临床，尤其是基于宫颈脱落细胞的HPV分型的高通量测序技术以其简便，快速，高通量，高准确性等特点，正逐步取代传统的宫颈巴氏涂片法，但是目前常规测序技术本身存在有一定的错误率，且由于个体差异，肿瘤发生发展时期，取材操作等原因，脱落细胞中的肿瘤细胞丰度往往存在很大波动，甚至0.1％左右的低丰度水平，从而导致基于常规测序技术仍然存在一定的假阴性以及假阳性。因此亟需一种准确率高、操作简便的测序技术用于脱落细胞DNA的检测，为疾病的早期筛查提供可信赖的检测手段。

发明内容

本发明提供一种脱落细胞DNA低频突变富集测序方法以克服现有技术的不足。

本发明提供的一种脱落细胞DNA低频突变富集测序方法，包括以下步骤：

(1)脱落细胞的DNA提取与打断；

(2)打断后的脱落细胞DNA文库构建；

(3)通用文库TT-COLD PCR扩增富集；

(4)探针富集捕获、杂交捕获产物的扩增与上机测序；

(5)正反双链纠错低频信息分析。

本发明方法的流程图见图1。

其中，步骤(1)所述的脱落细胞来自人类，步骤(2)的文库构建方法按照3步酶促反应，即末端修复，加“A”和文库接头连接。

文库接头使用的引物为：

接头第一链：TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT，

接头第二链：GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC。

本发明方法中，步骤(3)通用文库TT-COLD PCR扩增富集包括以下步骤：

1)确定文库的Tm值；

2)绕过每个插入片段存在的特异Tc值，基于1对通用引物，在1个系列的循环条件下，对文库中所有片段上的各种突变类型进行富集；设定Tc min≈TM-2.5，之后Tc以0.5℃逐步递增，在每个Tc条件下分别进行FULL COLD PCR；所述插入片段是指文库中与接头连接的DNA片段。

进一步地，文库Tm值通过以下方法来确定，对正常人脱落细胞DNA的文库采用一对引物使用荧光定量PCR，根据溶解曲线分析获得文库Tm值；所述引物的序列为：

上游引物：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT，

下游引物：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxxxGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，其中xxxxxxxx为index标签。

上述步骤2)中，所述1对通用引物为通用文库TT-COLD PCR引物，其核苷酸序列为：

上游引物：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT，

下游引物：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxxxGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，其中xxxxxxxx为index标签。

上述步骤2)中，所述1个系列循环条件为：