[发明专利]一种脱落细胞DNA低频突变富集测序方法

权利要求书

1.一种脱落细胞DNA低频突变富集测序试剂盒，其特征在于，含有富集探针芯片，芯片上探针是将基于人基因组参考序列hg19设计的探针替换为基于突变碱基设计的探针，其他位点探针不变，且热点变异探针总覆盖度与其他区域正常探针覆盖度的差异至少为3:1；

基于目标DNA突变碱基设计探针的方法为：根据目的基因的用途确定芯片捕获区间，参考目标DNA所属的数据库，在一定碱基范围内，确定至少1个最重要的热点变异位点，同时针对该位点存在的多种突变类型，以几种主要类型作为参考，基于相应的发生频率作为其在该位点总探针覆盖水平所占的比例。

2.一种脱落细胞DNA低频突变富集测序产品，包括：

(1)脱落细胞DNA提取与DNA打断单元；

(2)脱落细胞DNA文库构建单元；

(3)通用文库TT-COLD PCR扩增富集单元；

(4)探针富集捕获单元、杂交捕获产物的扩增与上机测序单元；

(5)正反双链纠错低频信息分析单元。

3.如权利要求2所述的产品，其特征在于，单元(3)的通用文库TT-COLD PCR扩增富集单元是基于通用引物对所有类型变异实现第一级突变富集扩增；所述通用引物的核苷酸序列为：

上游引物：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT，

下游引物：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxxxGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，其中xxxxxxxx为index标签。

4.如权利要求2所述的产品，其特征在于，单元(4)的探针富集捕获单元是针对热点变异通过富集探针芯片实现第二次富集捕获，所述富集探针芯片上探针是将原先基于人基因组参考序列hg19设计的探针替换为基于突变碱基设计的探针，其他位点探针不变，且热点变异探针总覆盖度与其他区域正常探针覆盖度的差异至少为3:1；

基于ctDNA突变碱基设计探针的原则为：基于TCGA、ICGC、COSMIC数据库确定芯片捕获区间，参考TCGA、ICGC、COSMIC数据库，在每200bp碱基范围内，确定至少1个最重要的热点变异位点，同时针对该位点存在的多种突变类型，以几种主要类型作为参考，基于相应的发生频率作为其在该位点总探针覆盖水平所占的比例。

5.如权利要求4所述的产品，其特征在于，所述的基因数据库为肿瘤基因数据库；所述的富集探针芯片针对228个基因，共5220个热点变异，228个基因如下：