[发明专利]一种GII.4型诺如病毒基因组扩增引物和扩增方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种GII.4型诺如病毒基因组扩增引物和扩增方法。

背景技术：

诺如病毒是全球流行性与散发性急性胃肠炎的重要病原，每年造成约2.3亿人次染病，在发展中国家尤为严重，至少导致20万例5岁以下儿童的死亡，对公共卫生安全造成了极大的威胁。诺如病毒感染为自限性疾病，但对于婴幼儿、老人及免疫缺陷人群会具有脱水性死亡的危险。至目前为止，还没有有效的抗病毒药物及治疗手段。

作为RNA病毒，诺如病毒极易变异，具有丰富的遗传多样性。根据其衣壳蛋白序列同源性可将病毒分成6个基因组(Genogroup)，基因组之间的核酸序列同源性约46％，其中GⅠ、GⅡ和GⅣ为人源病毒。同一基因组内的核酸同源性为69％～97％，进一步分成不同的基因型(Genotype)，例如GI含有8个基因型，GII含有19个(并不断增加)。其中，GII.4型是目前全球主要流行基因型，近80％的诺如病毒感染是由该型别毒株引起的，并且该病毒每隔两三年就会产生新的变异株，同时造成新一轮的大范围病毒流行。

尽管最近在人源诺如病毒培养方面有了突破性进展，但是合适的复制体系仍然缺乏。因此，基因组信息的获得对于诺如病毒研究具有重要意义。诺如病毒基因组长约7.5-7.8kb，包括3个开放阅读框。目前报道的基因组扩增方法有直接扩增法以及分段扩增法。其中，直接扩增方法往往难以具有较高的灵敏度，对待处理样本的质量具有较高的要求，因而不具有较高的成功率。另外，分段扩增法中常用的包括三段法以及多段法，而多段法的引物一般根据与待处理样本中病毒相似度高的基因组序列进行设计，因而对引物的广谱性也造成了一定的限制；三段法中扩增获得的片段长度较大(>3K)，这不但增加了扩增的难度，而且难以直接测序，从而降低了获得病毒基因组序列的成功率。

发明内容：

本发明的目的是提供一种高灵敏度的GII.4型诺如病毒基因组扩增引物和扩增方法。

本发明的GII.4型诺如病毒基因组扩增引物，其特征在于，包括六对扩增引物：

引物对1：P1F：5′-GTGAATGAAGATGGCGTCTAAC-3′；

P1596R：5′-TCGACGCCATTGCGTGGGA-3′；

引物对2：P1258F：5′-CAACCATATGACCACCTTGCT-3′；

P2805R：5′-ATGGCCACCTCCTCATAGTA-3′；

引物对3：P2689F：5′-AGGTCTCAGTGATGAAGAG-3′；

P4248R：5′-GGGCCATCCTCATTCATATTCA-3′；

引物对4：P4099F：5′-TGGTAAGATCAAGAAGAGGCT-3′；

G2SKR：5′-CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3′；

引物对5：NV2of2：5′-GGAGGGCGATCGCAATC-3′；

GV132：5′-CCRGCRAAGAAAGCTCCAGCCAT-3′；

引物对6：P6484F：5′-CAGCACAATCTGATGTGGC-3′；

P7513R：5′-TTACACCCGTGACTCCCCT-3′。

本发明的第二个目的是提供一种GII.4型诺如病毒基因组的扩增方法，其特征在于，分别以上述引物P1F/P1596R、P1258F/P2805R、P2689F/P4248R、P4099F/G2SKR、NV2of2/GV132和P6484F/P7513R作为扩增引物的上下游引物，以GII.4型诺如病毒的RNA为模板进行RT-PCR扩增，分别得到扩增产物，然后对扩增产物进行核酸序列测定，然后再拼接比对，得到GII.4型诺如病毒基因组全长序列。

优选，所述的RT-PCR，其反应体系为：含有2×one-step RT-PCR mixture 10μL，10μmol/L上游引物和10μmol/L下游引物各0.6μL，MLV/RNasin/HS-Taq酶混合液0.8μL，RNA模板2μL，其余由双蒸水补足至20μL，反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃30s，55℃30s，72℃80s，共30次循环后，72℃最后延伸7min。