[发明专利]抗菌肽-溶菌酶融合蛋白的制备方法及其应用

说明书

本发明提供一种抗菌肽‑溶菌酶融合蛋白，该蛋白从N端‑C端依次包含抗菌肽thanatin蛋白、3GSA柔性肽、T4溶菌酶蛋白。制备方法如下：采用人工合成获得包含抗菌肽thanatin、3GSA柔性肽、T4溶菌酶编码基因序列；以pETDuet质粒为载体，构建重组质粒；转化至BL21中，筛选获得表达菌株；挑取单克隆至LB培养基，进行蛋白诱导，得到在上清表达的融合蛋白；融合蛋白纯化，切除Sumo标签，得到目的抗菌肽‑溶菌酶融合蛋白。该蛋白被证明在提高仔猪成活率、降低保育猪的腹泻率、降低保育猪的呼吸道病发病率方面具有显著效果，可用于制备相关药物制剂。

技术领域

本发明涉及生物技术制药工程技术领域，尤其涉及一种抗菌肽-溶菌酶融合蛋白的制备方法，以及该融合蛋白在提高仔猪成活率以及降低保育猪的腹泻率、呼吸道病发病率中的应用。

背景技术

自抗生素问世以来，其在人类与动物的疾病治疗方面发挥了至关重要的作用，不仅如此，抗生素作为人类的食品添加剂和动物饲料添加剂的应用也越来越多。正是由于抗生素被广泛的应用甚至滥用，细菌的耐药性越来越来强，由此带来的抗生素的杀菌效果越来越差，甚至出现一些抗生素无法杀死的超级细菌。因此寻找新的抗菌物质的任务迫在眉睫。

近些年出现的抗菌肽和溶菌酶是一类具有杀菌活性的天然多肽和蛋白，其做为抗生素替代品已广泛的应用于医药临床和食品工业。1981年，人们第一次真正意义上发现抗菌肽Cecropin，迄今为止仅在昆虫中就发现了超过2000种抗菌肽类物质，这些抗菌肽不仅对细菌、真菌有抗菌能力，对病毒、原虫及癌细胞也有一定作用。溶菌酶作为机体非特异免疫因子之一，也具有多种药理功效，如抗菌消炎、抗病毒、增强免疫力、止血、凝血等。抗菌肽的抗菌机理为带正电荷的抗菌肽与带有负电荷的细菌细胞膜结合，通过造成膜穿孔的或抑制细菌的生理代谢过程造成细菌死亡。溶菌酶又称为胞壁质酶，其通过分解细胞壁上肽聚糖的β-(1,4)糖苷键发挥其杀菌作用。目前，抗菌肽和溶菌酶主要都是单独存在而发挥其抗菌功能，但由于其杀菌机理的不同，对不同菌株的杀菌方面具有一定的局限性，导致其各自有较窄的抗菌谱，不能达到很好的杀菌效果。

公告为CN101649311B的中国发明专利公开了一种人溶菌酶-抗菌肽融合蛋白的制备方法，它采用基因工程的方法构建人溶菌酶-抗菌肽重组质粒，然后在真核表达人溶菌酶-抗菌肽融合蛋白，该融合蛋白的表达体系构建成本高，蛋白表达量少，不利于工业化生产。

目前也有研究者试图在原核表达溶菌酶-抗菌肽融合蛋白，但是进展不佳，要么融合蛋白不能够成功表达，要么融合蛋白虽然能够表达，但是只能表达在包涵体，导致后期纯化复性难度大，对蛋白活性影响大，从而影响其后期功能实现和进一步应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服以上现有技术问题的不足，提供一种抗菌肽-溶菌酶融合蛋白以及该融合蛋白的制备方法，该融合蛋白的表达体系采用在原核表达融合蛋白，体系构建成本低，蛋白表达量大，更利于工业化生产，且融合蛋白成功表达在上清，有利于融合蛋白后期的纯化复性，有利于保持融合蛋白的活性。

本发明所采用的技术方案为提供一种抗菌肽-溶菌酶融合蛋白，它从N端-C端依次包含了抗菌肽thanatin蛋白、3GSA柔性肽、T4溶菌酶蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该融合蛋白是通过基因工程把抗菌肽thanatin(死亡素)的密码子与T4溶菌酶的密码子串联起来，中间插入3GSA作为一段柔性肽，避免蛋白表达后抗菌肽与溶菌酶的结构相互影响从而影响其各自的活性，并通过其N端与sumo蛋白结合，成功构建能够在原核表达、并表达在上清的重组蛋白，其中抗菌肽thanatin蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，3GSA柔性肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，T4溶菌酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

上述抗菌肽-溶菌酶融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：