[发明专利]适用于选育具备红皮性状的柚子共显性RFP分子标记及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及柑橘分子育种技术领域，具体地指一种适用于选育具备红皮性状的柚子共显性RFP分子标记及其应用，该分子标记可以作为柚子红皮分子育种标记辅助选择，为培育遗传稳定的红皮柚子新品种提供新的分子标记。

背景技术

柚子(Citrus grandis)是芸香科柑橘属水果，味道酸甜，营养价值高，含有丰富的蛋白质、维生素及钙、磷、铁等人体必需的元素。柚子有健脾胃、润肺、助消化等功效，深受人们喜爱。我国柚类资源丰富,现在市场上较常见的柚品种大多数都是黄色或淡黄色外果皮，色泽单一。但红皮柚属于果皮色泽突变体，其成熟果实的表皮是红色的，红皮柚是柚资源中罕见的在外果皮上合成和积累花青素的品种资源，使果实呈现绚丽色彩，对消费者极具吸引力，且红色是中国文化中“吉祥”的象征，具有重要的文化内涵。对于果实品质研究来说，色泽是果实外观品质的核心，具有重要的观赏和经济价值。

传统的柚子品种大部分是黄色或淡黄色外果皮，因不能在果皮上积累花青素而色泽单一，通过传统的表型选择方法将红皮这个特征导入传统柚子品种中又存在育种周期长、效率低等缺点。现代生物技术为作物育种提供了强有力的工具，分子标记辅助选择技术就是其中重要的一项技术，与传统表型选择相比，分子标记辅助选择可在任何生长期进行，不受环境条件影响，可排除非等位基因相互作用而造成的干扰，具有快速、经济、效率、准确性强等优点。在柑橘红皮育种过程中可借助分子标记对杂交后代进行直接而快速的背景选择，缩短育种年限。

发明内容

本发明所要解决的技术问题就是提供一种适用于选育具备红皮性状的柚子共显性RFP分子标记及其应用；其为柚子红皮分子育种提供一种简单、快速和有效地辅助选育方法。

为解决上述技术问题，本发明提供的一种适用于选育具备红皮性状的柚子共显性RFP分子标记，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

本发明还提供了一种用于获得分子标记的引物对，所述引物对分别为：

引物对RFP F/R1(在序列表中的命名分别为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8)

正向引物5'-CATTCATACAGGACTCGACTAGCTT-3'，

反向引物5'-TGTATGAATGGGACCTGTCTATGG-3'；

引物对RFP F/R2(在序列表中的命名分别为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10)

正向引物5'-GGATGACGGGAGATGTTTGTTAC-3'，

反向引物5'-TCCTTACCTCCTTTTTGGACCTA-3'。

本发明还提供了一种适用于选育具备红皮性状的柚子共显性RFP分子标记制备方法，包括以下步骤：

1)以红皮柚和普通柚两个基因组DNA为模板，采用引物对MYB2F/R(在序列表中的命名分别为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6)：

正向引物5'-TGGAGAGACCCACGGAAAGA-3'，

反向引物5'-TCTTCTTACAGTCCAGGACCCTTT-3'；

扩增调控花青素合成关键转录因子CgMYB2基因的启动子，得到两个DNA扩增片段；

2)对所述的DNA扩增片段进行克隆、测序，其中从红皮柚中扩增得到如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，从CK柚中扩增得到如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

PCR反应体系如下：4μl 5XPCR buffer，0.4uL dNTPs(10mM)，0.2uL phusion hotstart酶(均购自于Thermo公司)，100ng DNA，正、反向引物各1μL，ddH₂O补充至终体积20ul。热循环参数为：98℃1min；98℃30sec，60℃30sec，72℃1min，32个循环；72℃10min，1个循环；4℃保存，反应是在S1000Thermal Cycler PCR仪上完成；

3)将所述的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的核苷酸序列进行比对发现，在SEQ ID NO：1中间有一段162bp的插入突变，导致序列特异扩增区域多态性；

4)根据SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列差异设计引物对RFP F/R1和RFP F/R2：