[发明专利]一种基于短序列高通量测序检测肉制品材料来源的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种基于短序列高通量测序检测肉制品材料来源的方法。

背景技术

随着经济的发展和人民生活水平的提高，肉类和肉制品的消费发展极为迅猛，由于不同品种肉类的价值差异巨大，错误标签和以次充好的现象越来越多。确定产品所用的肉类、进行产品标签信息的验证，能够起到保护消费者权益、打击造假和错误标签，保障进出口产品质量的作用。而确定产品所用肉类必须要有可靠而准确的肉类物种鉴别方法。

肉类的物种鉴定，主要有形态学方法和分子生物学方法。传统的形态学鉴定方法是在演化的背景下依据形态和结构、生理和生化特征、行为习性表现以及少量的化石资料来构建生物物种之间的关系。传统的形态学鉴定方法只适用于完整形态的肉的样品，一旦进行了加工，如鱼肉片、肉糜等，那些用于鉴定的特征就可能被破坏，形态学鉴定就会变得困难，也会导致结果不准确。

但无论如何加工，该动物的DNA始终存在和不可改变，因此采用DNA信息对肉制品原料来源进行鉴定，是一个不错的选择。2003年，加拿大动物学家Paul Hebert等提出线粒体细胞色素C氧化酶亚基(COI)基因序列中碱基序列的差异能很好地区分所有的研究物种。该种基于DNA信息鉴定区分物种的方法，具有较高的准确性。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种借助分子生物学手段，对肉制品进行DNA信息采集后，基于短序列高通量测序的方法，以待测肉制品的COI序列信息对肉制品原料来源进行检测鉴定的方法。

为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了一种基于短序列高通量测序检测肉制品材料来源的方法，包含下述步骤：

(1)提取待测肉制品的基因组DNA；

(2)设计并合成COI通用引物序列，其中，正向引物如SEQ ID NO:1所示，反向引物如SEQ ID NO:2所示：

SEQ ID NO:1：5’-GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC-3’；

SEQ ID NO:2：5’-TANACYTCNGGRTGNCCRAARAAYCA-3’；

其中，W代表A/T、Y代表C/T、N代表A/G/C/T、R代表A/G。

(3)采用步骤(2)中所述的正向引物和反向引物，以步骤(1)中所提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后对PCR产物进行纯化；

(4)对步骤(3)中纯化后PCR产物进行定量，并等量混样，构建标准文库，然后进行高通量测序；

(5)根据步骤(4)中测序的结果，得到待测肉制品的COI序列信息，由此得出待测肉制品的材料来源。

本发明的实施方式采用短序列高通量测序的方法，对待测肉制品的DNA信息进行采集，并通过COI本地数据库，对样品材料来源及比例进行检测。在以所提取的待测肉制品基因组DNA为模板进行PCR扩增反应时，本发明在对COI保守序列进行充分分析后，选取保守序列设计引物，并在这些引物对中挑选适合Illumia Miseq测序平台读长的引物对，最终确定SEQ ID NO:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物。上述引物是适用于多种脊椎动物和无脊椎动物的COI广谱通用引物，由于一些深加工的肉制品中材料来源多样化，因此本发明所设计的广谱通用引物确保了后续扩增的效率及鉴定的准确性。在通过短序列高通量测序得到待测肉制品基因组DNA的COI序列信息后，对得到的COI序列信息在数据库中进行比对，进而得到物种信息。利用本发明的实施方式所提供的鉴定方法，可对各种肉制品的材料组成和来源进行鉴定，由于COI基因序列中碱基序列的差异能很好地区分物种，因此利用该方法对肉制品材料来源进行检测鉴定具有较高的准确性。