[发明专利]一种从单克隆抗体中制备N-连接糖肽的方法及N-连接糖肽

说明书

本发明提供了一种利用二维色谱分离技术，从单克隆抗体中制备N‑连接糖肽组分的高效分离制备方法，其主要的成分为肽段序列为EEQYNSTYRN的N‑连接糖肽组分。工艺过程为：将单克隆抗体用胰蛋白酶酶解后，离心浓缩，浓缩液用一维色谱柱去除酶解液中的盐、多肽及残余蛋白，收集目标馏分。将收集到的馏分离心浓缩，将浓缩液通过二维色谱柱，利用二维色谱分离的正交性，除去残余的小肽，得到纯度较高的N‑连接糖肽组分样品。

技术领域

本发明涉及从单克隆抗体中分离制备N-连接糖肽组分的提取分离制备，具体的说是从单克隆抗体中酶解分离制备得到有9个氨基酸肽段的N-连接糖肽组分，该组分中的聚糖为5－15个甘露糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、岩藻糖或唾液酸组成，分子量在2000－4000。

背景技术

蛋白质糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰，在真核生物，尤其是哺乳动物中约有一半以上的蛋白质是被糖基化的，膜蛋白则几乎100％是以糖基化的形式而存在(Apweiler R,Hermjakob H,Sharon N,On the frequency of protein glycosylation,asdeduced from analysis of the SWISS-PROT database.Biochim Biophys Acta-GenSubj,1999,1473,4-8)。糖基化对蛋白质的结构和功能有着重要影响，如蛋白质的折叠、运输以及定位等。糖蛋白的糖链在细胞间的识别、黏附、通信联络以及免疫应答等方面均起着重要作用，除此之外，蛋白质糖基化的异常与肿瘤、发育、免疫异常以及感染等疾病的发生发展和诊断治疗也有密切关系。目前，已知肿瘤、类风湿等疾病会引起糖链结构的异常改变，因此，糖链被认为是一种潜在的疾病标志物和新疫苗的靶点(Ohtsubo K,Marth JD,Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease.Cell 2006,126,855-867；Kim EH,Misek DE,Glycoproteomics based identification of cancerbiomarkers.International journal of Proteomics,2011,2011,1-10)。由于糖肽仅占所有酶解后肽段的小部分(2-5％)，其质谱响应很容易被高丰度非糖肽抑制。同时，由于糖链的微观不均一性，一个糖基化位点上的糖链类型可能多达几十种，进一步降低了糖链的相对量而使得它们很难被检测到，这些使得糖蛋白糖肽的分离制备变得异常艰难。尽管糖链不容易得到，但是去除了蛋白质中非糖肽、磷酸化肽及其它肽段的影响，在高纯度糖肽基础上，研究糖链的结构信息，发现一些潜在的诊断标志物和治疗靶点将会变得更加简便、直接，更容易获得准确的结果，因此对于糖肽的分离制备，迫切需求一种高效、高通量的分离制备方法。为了得到结构单一的糖肽标准品，将糖肽混合物从酶解液中富集分离出来是首要步骤。

二维液相色谱技术是一门新兴技术，是用两根性质相同或不同的色谱柱对复杂样品进行分离。作为一种分析复杂样品的理想工具，它已被广泛应用于医药卫生、食品科学、环境和农业科学等各个领域。近年来，随着二维液相色谱理论及应用的发展，二维制备液相色谱也逐渐发展起来。与单维制备液相色谱相比，二维制备液相色谱不但具有更高的峰容量，而且两维具有不同的选择性。

酶法释放糖蛋白糖链因方法简单、条件温和、能够提供有关糖链残基组成、排列顺序和糖苷键的构型等信息，目前应用较广，其中胰蛋白酶(Trypsin)应用更为广泛。到目前为止，虽然对血清中免疫球蛋白、单克隆抗体的Trypsin酶解糖链释放、结构表征的研究很多，但大多数研究仍集中在用质谱方法检测酶解液中的糖肽。同时，随着对糖肽结构的不断认识，对其功能的研究越来越引起人们的兴趣，这使得对于糖肽样品的获取迫在眉睫。然而，到目前为止，从单克隆抗体酶解液中将糖肽富集分离出来，并通过二维液相色谱分离制备得到纯度较高的糖肽组分，还未见报道。

发明内容