[发明专利]一种从单克隆抗体中制备N-连接糖肽的方法及N-连接糖肽

权利要求书

1.一种从单克隆抗体中制备N-连接糖肽的方法，其特征在于：

1）蛋白变性：单克隆抗体样品中加入尿素的缓冲溶液进行反应，反应产物中加入二硫苏糖醇进行反应，产物中加入碘代乙酸，避光反应得到变性蛋白溶液；

2）酶解：向步骤1）得到的变性蛋白溶液中加入酶，进行酶解反应，得到酶解反应产物；酶解反应之前，变性蛋白溶液用碳酸氢铵缓冲溶液稀释5-10倍后再加入酶，上述碳酸氢铵缓冲溶液，浓度为30-80 mM；酶解反应pH值为7-9，温度为35-40℃，反应时间为10-24小时；酶解后得到的酶解液在沸水中煮5-10分钟使酶失活得到酶解反应产物；所述酶是胰蛋白酶；酶和初始单克隆抗体的质量比为1:10-1:50；

3) 对步骤2）得到的酶解反应产物进行二维液相色谱分离制备，收集的组分干燥后即为N-连接糖肽组分；

步骤3）以硅胶为基质的键合材料为色谱柱填料，Unitary C18或XAqua为一维反相填料，XAmide或XIon为二维亲水填料；

步骤3）所述的二维液相色谱分离制备中一维制备采用的硅胶基质键合材料的粒度为2-20微米，色谱柱具体尺寸为柱径3mm，柱长150mm、柱径3mm，柱长250mm或柱径4.6mm，柱长150mm中的一种，一维液相色谱制备采用的流动相为甲醇或乙腈中的一种或二种与水混合，其中甲醇或乙腈为有机相，不含或含有0.1 v%甲酸，水相中不含或含有0.1 v%甲酸；洗脱条件按照有机相体积分数5-30%等度或5-50分钟有机相体积分数由5%提高到40%梯度进行；柱温为25-40℃，洗脱液总流速为0.2-1.0 mL/min，收集保留时间为10-30 min的组分；二维制备采用的硅胶基质键合材料的粒度为2-20微米，色谱柱具体尺寸为柱径2.1mm，柱长150mm、柱径3mm，柱长150mm、柱径4.6mm，柱长150mm或柱径4.6mm，柱长250mm中的一种，采用的流动相为乙腈作为有机相与水作为水相混合，洗脱条件按水相体积分数10-50%等度或经5-30分钟水相体积分数由10-15%提高到30-60%梯度进行，柱温为25-40℃，洗脱液总流速为0.2-1.0 mL/min，收集保留时间为10-30min的组分。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中单克隆抗体样品在尿素的缓冲溶液中进行反应的条件为20－30℃温育，缓冲溶液pH值为7-9，反应时间为1-5小时；加入二硫苏糖醇后反应条件为35-40℃温育，反应时间为1-5小时；加入碘代乙酸后的反应条件为避光20-30℃温育，反应时间为10-60分钟。

3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）缓冲溶液中尿素的浓度为4-10 M；所使用的缓冲溶液为碳酸氢铵缓冲溶液，浓度为30-80 mM；缓冲溶液中加入的单克隆抗体与尿素的质量比为1:1-1:40；

所述二硫苏糖醇，加入后其在体系中的终浓度为30-100 mM，初始单克隆抗体质量与二硫苏糖醇的质量比为14:1-140:1；

所述碘代乙酸，加入后其在体系中的终浓度为30-100 mM，初始单克隆抗体质量与碘代乙酸的质量比为18:1-180:1。

4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述一维制备，流动相为含有或不含有0.1 v%甲酸的乙腈与含有或不含有0.1 v%甲酸的水混合，采用等度方式，乙腈体积比例为8%-15%；二维制备流动相为含有或不含有0.1 v%甲酸的乙腈与含有或不含有0.1 v%甲酸的水混合，采用梯度条件，含有或不含有0.1 v%甲酸的水体积浓度为15%，保持5分钟，再经15-20分钟增加到35%-45%。

5. 使用权利要求1-4任一方法制备的N-连接糖肽，其特征在于：其主要成分是9个氨基酸肽段的N-连接糖肽组分，其肽段序列为EEQYNSTYR， N-连接聚糖是以两个N-乙酰葡萄糖胺和3个甘露糖组成的五糖核心基础上，再连接总数为0－10个的甘露糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、岩藻糖或唾液酸中的一种或二种以上；N-连接糖肽的分子量为2000－4000。