[发明专利]一种副溶血弧菌快速检测试剂及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用环介导扩增（LAMP）技术进行菌样的快速检测的试剂及方法，具体是一种副溶血弧菌快速检测试剂及检测方法。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)广泛存在于海水和海产品中，是我国沿海地区常见的食物中毒病原菌。副溶血弧菌嗜盐畏酸，在无盐培养基上，不能生长，3%~6%食盐水繁殖迅速，每8~9分钟为1周期，低于0.5%或高于8%盐水中停止生长。在食醋中1~3分钟即死亡，56℃加热5~10分钟灭活，在1%盐酸中5分钟死亡。

已知副溶血弧菌有12种O抗原及59种K抗原，据其发酵糖类的情况可分为5个类型。各种弧菌对人和动物均有较强的毒力，其致病物质主要有分子量42000的致热性溶血素(TDH)和分子量48000的TDH类似溶血毒(TRH)，具有溶血活性、肠毒素和致死作用。副溶血性弧菌食物中毒也称嗜盐菌食物中毒，是进食含有该菌的食物所致，主要来自海产品或盐腌渍品，常见者为蟹类、乌贼、海蜇、鱼、黄泥螺等，其次为蛋品、肉类或蔬菜。临床上以急性疾病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。主要病理变化为空肠及回肠有轻度糜烂，胃粘膜炎、内脏(肝、脾、肺)淤血等。

副溶血弧菌的高致病性已引起世界范围的关注，目前已列为水产养殖业和进出口水产重点检验检疫的致病菌之一。该菌的检测方法曾经以分离培养和理化鉴定为主，整个过程耗时费力，灵敏度底，不能满足快速检测的需要。在特异性方面，由于副溶血弧菌的表型不稳定，非典型菌株较为常见，采用普通的理化鉴定得到的检测结果可靠性差；酶联免疫吸附试验虽然具有一定的特异性和敏感性，但仍然需要结合细菌分离才可进行，仍然不是一种快速检测方法。RT-PCR方法检测副溶血弧菌是一种新的检测技术，其简便、快速、准确，灵敏特异性好等特点，但需要昂贵的PCR仪，以及不同的操作温度。

环介导等温扩增（LAMP）是继PCR技术发展起来的基于检测遗传物质DNA的一种新的扩增技术。该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速、高特异地扩增靶序列；其特点是无需特殊的、昂贵的检测仪器，只需简单的恒温设备或者是加热模块，即可完成PCR扩增，可以满足现场检测的需要。环介导等温扩增方法近几年在病原体检测方面运用较多。。

发明内容

本发明提供一种操作简单、结果准确的副溶血弧菌快速检测试剂及检测方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一组特异性强、灵敏度高的用于检测副溶血弧菌的LAMP引物，该组引物是依据NCBI收录号M36437(tlh)对应的基因序列设计的，由引物表序列F3、B3、FIP、BIP所示碱基序列的寡核苷酸组成；其中F3为外侧上游引物，B3为外侧下游引物，FIP为内侧上游引物，BIP为内侧下游引物。

本发明达到的有益效果：

本发明中所提供的引物具有以下优点：（1）高效灵敏，众多研究文献表明LAMP引物相比普通PCR具有检测灵敏度高，反应时间短的优点（2）特异性强，用于引物设计的基因序列tlh，是副溶血弧菌的一段特异性基因。通过选用外侧上游引物、外侧下游引物、内侧上游引物、内侧下游引物，保证了检测的特异性，多引物启动的方式，增强了其检测的灵敏度，通过优化组份和反应条件，加快了反应速度，缩短了检测所用的时间，具有更高的临床应用价值。

本发明提供了一种副溶血弧菌快速检测试剂，主要包括下列组分：

（1）10*反应缓冲液^※1

（2）dNTPMixture:10mMeach

（3）甜菜碱：5mol/L

（4）MgSO₄:150mmol/L

（5）Bst酶：8000U/mL

（6）染料:钙黄绿素4mmol/L

（7）阴性对照：去离子水

（8）FIP引物（20μmol/L）

GCCCATTCCCAATCGGTCG-TTTT-GTATGTTTGCGGCTGTTGGTATCG

BIP引物（20μmol/L）

GTTCTACACCCAACACGTCGCA-TTTT-TCGCCAAATTCTAATGTTGCTTC

F3引物（8μmol/L）ATTGTCAGCGGCGAAGAA

B3引物（8μmol/L）CAGCACGCAAGAAAACCA

（9）阳性对照DNA^※2

※1:组成