[发明专利]一种用于快速鉴定腿端黑实蝇的种特异性引物对、试剂盒及鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种用于快速鉴定腿端黑实蝇的种特异性引物对、试剂盒及鉴定方法。

背景技术

腿端黑实蝇，拉丁学名为：Bactrocera atrifemur Drew&Hancock，为桔小实蝇复合种之一(Drew and Hancock，1994)，属双翅目Diptera实蝇科Tephritidae果实蝇属Bactrocera，是一种重要的入侵检疫性害虫。现今主要分布在马来西亚，我国于2010年首次截获，暂未在我国分布(黄振等，2011)。

腿端黑实蝇作为具有重大经济意义的检疫性有害生物，其主要传播途径为：以卵、幼虫或蛹随被害果传播。由于我国的地理位置、气候以及寄主等方面适合其生殖繁衍，成为腿端黑实蝇的集中危害地区，致使许多果蔬类产品的生产受到影响，从而导致国内外贸易受到影响。因此，随着国际贸易的日渐频繁，合作领域不断拓宽，在进出境的果蔬中经常截获各种不同的实蝇幼虫、卵或蛹，甚至为头、胸、翅、足等残体，如何快速准确的鉴别其是否为腿端黑实蝇，从而保证我国农业生产安全，具有重要现实意义。

由于对腿端黑实蝇的成虫形态鉴别远比对幼虫、卵或蛹的鉴别容易，因此，为了保证鉴定的准确性目前的检疫监管机构，通常采用的腿端黑实蝇疫情的鉴别方法为形态学鉴别方法，即：首先将截获的实蝇幼虫、卵或蛹在室内饲养为成虫，然后通过观察成虫形态，而鉴别其是否为腿端黑实蝇。该种鉴别方法存在的主要问题为：(1)将幼虫、卵或蛹饲养为成虫，需要花费较长的时间，严重影响了果蔬进出口贸易的通关速度；(2)如果截获果蔬中实蝇的头、胸、腹、翅、足等残体，由于无法将上述残体饲养为成虫，因此，无法准确识别所截获的残体是否为腿端黑实蝇的残体，具有较大的鉴别局限性。

因此，现有技术中，为了防止检疫性实蝇传入以及扩散，迫切需要一种可克服形态学鉴别方法的不足、能够快速准确鉴定腿端黑实蝇的鉴别方法。

发明内容

针对现有技术存在的缺陷，本发明提供一种用于快速鉴定腿端黑实蝇的种特异性引物对、试剂盒及鉴定方法，能够快速准确的对截获的疑似腿端黑实蝇的幼虫、卵、蛹，以及头、胸、翅、腹、足等残体进行鉴别。

本发明采用的技术方案如下：

本发明提供一种用于快速鉴定腿端黑实蝇的种特异性引物对，包括上游引物TF37和下游引物TR480；

所述上游引物TF37的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述下游引物TR480的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供一种用于快速鉴定腿端黑实蝇的试剂盒，所述试剂盒包括以下引物：

上游引物TF37，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

下游引物TR480，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

优选的，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液中的至少一种；所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明还提供一种采用权利要求1所述的种特异性引物对快速鉴定腿端黑实蝇的方法，包括以下步骤：

S1，设计腿端黑实蝇的种特异性引物对；其中，所述腿端黑实蝇的种特异性引物对包括上游引物TF37和下游引物TR480；

其中，上游引物TF37的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；下游引物TR480的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

S2，提取被鉴定生物体的DNA；

S3，以S2提取的DNA为模板，使用S1得到的所述腿端黑实蝇的种特异性引物对进行SS-PCR扩增反应；

S4，采用电泳检测SS-PCR扩增产物，判断所述SS-PCR扩增产物是否含有444bp的特征条带，如果含有，则所述被鉴定生物体为腿端黑实蝇种；反之，则所述被鉴定生物体不为腿端黑实蝇种。

优选的，S1中，通过以下方法设计得到腿端黑实蝇的种特异性引物对：

S1.1，选用腿端黑实蝇的标本，采用试剂盒法从所述腿端黑实蝇的标本中提取腿端黑实蝇的基因组DNA。

优选的，S2中，所述被鉴定生物体的DNA具体为：来自卵生物形态的DNA、来自幼虫生物形态的DNA、来自蛹生物形态的DNA、来自生物残体的DNA；

其中，所述生物残体指头、胸、腹、翅或足；

此外，通过以下方法，提取被鉴定生物体的DNA：