[发明专利]一种用于快速鉴定腿端黑实蝇的种特异性引物对、试剂盒及鉴定方法

权利要求书

1.一种用于快速鉴定腿端黑实蝇的种特异性引物对，其特征在于，包括上游引物TF37和下游引物TR480；

所述上游引物TF37的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述下游引物TR480的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种用于快速鉴定腿端黑实蝇的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下引物：

上游引物TF37，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

下游引物TR480，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.根据权利要求2所述的用于快速鉴定腿端黑实蝇的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液中的至少一种；所述试剂盒还包括标准阳性模板。

4.一种采用权利要求1所述的种特异性引物对快速鉴定腿端黑实蝇的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，设计腿端黑实蝇的种特异性引物对；其中，所述腿端黑实蝇的种特异性引物对包括上游引物TF37和下游引物TR480；

其中，上游引物TF37的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；下游引物TR480的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

S2，提取被鉴定生物体的DNA；

S3，以S2提取的DNA为模板，使用S1得到的所述腿端黑实蝇的种特异性引物对进行SS-PCR扩增反应；

S4，采用电泳检测SS-PCR扩增产物，判断所述SS-PCR扩增产物是否含有444bp的特征条带，如果含有，则所述被鉴定生物体为腿端黑实蝇种；反之，则所述被鉴定生物体不为腿端黑实蝇种。

5.根据权利要求4所述的种特异性引物对快速鉴定腿端黑实蝇的方法，其特征在于，S1中，通过以下方法设计得到腿端黑实蝇的种特异性引物对：

S1.1，选用腿端黑实蝇的标本，采用试剂盒法从所述腿端黑实蝇的标本中提取腿端黑实蝇的基因组DNA。

6.根据权利要求4所述的种特异性引物对快速鉴定腿端黑实蝇的方法，其特征在于，S2中，所述被鉴定生物体的DNA具体为：来自卵生物形态的DNA、来自幼虫生物形态的DNA、来自蛹生物形态的DNA、来自生物残体的DNA；

其中，所述生物残体指头、胸、腹、翅或足；

此外，通过以下方法，提取被鉴定生物体的DNA：

选用整只腿端黑实蝇、或腿端黑实蝇的残体、或腿端黑实蝇的卵、幼虫或蛹作为样本；将所选用的样本置于2ml离心管中，加入液氮充分研磨；然后，将研磨后的样本采用OMEGA E.Z.N.A.^TM Insect DNA Kit试剂盒法提取DNA，并将最终提取到的DNA保存于-20℃备用。

7.根据权利要求4所述的种特异性引物对快速鉴定腿端黑实蝇的方法，其特征在于，S3中，所述SS-PCR扩增的反应体系以25ul计，包括：

8.根据权利要求7所述的种特异性引物对快速鉴定腿端黑实蝇的方法，其特征在于，所述SS-PCR扩增的反应条件为：93～95℃预变性4～6min；93～95℃变性35～45s；退火温度50～60℃，25～35s；72℃延伸0.5～1.5min；20～30个循环，最后72℃延伸7～10min停止反应。

9.根据权利要求8所述的种特异性引物对快速鉴定腿端黑实蝇的方法，其特征在于，所述SS-PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性40s；退火温度55℃，30s；72℃延伸1min；30个循环，最后72℃延伸7min停止反应。

10.根据权利要求4所述的种特异性引物对快速鉴定腿端黑实蝇的方法，其特征在于，S4中，所述采用电泳检测SS-PCR扩增产物，判断所述SS-PCR扩增产物是否含有444bp的特征条带，具体为：

S4.1，提取SS-PCR扩增后的5ul SS-PCR产物；

S4.2，在含DNA染色剂的1.5％的琼脂糖凝胶多功能电泳仪上，对所述5ul SS-PCR产物120V电泳30min；

S4.3，利用凝胶成像分析仪检测电泳后是否扩增出444bp的特征条带。