[发明专利]一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法

说明书

所属技术领域

本发明属于基础研究领域，涉及超声微泡的制备方法，尤其涉及一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法。

背景技术

超声微泡(microbubble，MB)，即超声造影剂的主要成分，具有安全性高、能增强超声散射强度和产生丰富谐波信号的特点，被广泛应用于多种类型的疾病诊断，显著提高疾病诊断的灵敏性和特异性，运用超声造影剂进行超声成像已经成为超声诊断工作中重要的组成部分。

近年来，随着超声分子影像学的发展，超声微泡的使用不再仅仅局限于成像领域，通过生化技术对超声微泡进行适当改造，可以将药物或基因携载于微泡表面、壳层或内部而用于疾病治疗，具有广阔的发展及运用前景。给予一定声强的超声辐照时，微泡发生振动、膨胀和压缩运动，当声场较强时甚至发生破裂崩溃，这时微泡周围引发高温高压、微射流、冲击波、切边应激力等多种能量释放，产生的生物学效应不仅能够引起辐照区域血管内皮细胞间隙增宽，为基因、药物穿越内皮屏障创造有利条件，还可影响细胞膜流动性，使细胞膜磷脂双分子层结构发生可自我修复的断裂，导致瞬时可逆的细胞膜微孔产生，Ca2+内流促使细胞膜通透性增加，将更多的药物或基因传递入细胞内发挥作用，从而改善治疗效果。研究证明，超声微泡联合超声辐照介导的肿瘤治疗具有安全系数高、靶向破坏微泡释放治疗物质、促进治疗物质渗透入病变组织的特点，尤其在递送基因具有巨大的应用潜力和独特的优势，例如提高细胞对质粒DNA的摄取，通过调节超声参数及改变超声辐照部位更方便有效地调控基因转染等。

然而，与其他基因传递系统相比，目前超声微泡携带质粒DNA的能力较低，且难以实现微泡在肿瘤细胞周围的聚集，以至给予超声辐照时进入肿瘤细胞内的基因数量受到限制，从而影响转染率。阳离子材料聚醚酰亚胺(PEI)是一种多用途的阳离子聚合物，能够中和DNA电荷，增加DNA与细胞膜的相互作用并促进细胞内吞，是常用的转染试剂。研究表明，PEI与超声具有协同作用，PEI修饰的微泡能通过正负电荷相吸作用携带更多的DNA，在超声介导下有效地提高基因转染效率。对于质粒DNA靶向聚集问题，微泡进行靶向修饰是一个很好的解决方案，通过在微泡表面连接上针对某种肿瘤的特异性抗体或配体，使其能够特异性识别靶细胞而靶向聚集到病灶内。利用靶向微泡携带传输基因不仅可以实现基因在靶细胞富集，为实现基因高效转染提供必要的先决条件，同时也大大降低微泡在正常组织的浓度，极大地减少了对正常组织产生副作用的可能。有研究表明，双靶向微泡能与不同的肿瘤细胞表面标记性分子结合，更好地克服血流剪切力的影响，增加超声微泡与肿瘤靶细胞的粘附机会，增强微泡的靶向效能，从而提高其所携带基因在靶组织的富集程度。整合素是细胞黏附分子家族中的一类生物分子，由125kDa的αv亚基和105kDa的β亚基形成跨膜异二聚体，在肿瘤血管内皮细胞及部分肿瘤细胞上均呈高表达，而在休眠状态的内皮细胞和正常细胞上几乎不表达，广泛参与细胞之间的相互作用及肿瘤血管的生成，与肿瘤细胞的粘附，增殖和迁移密切相关，其中整合素αvβ3(Integrinαvβ3)的作用尤为重要，是许多抗肿瘤血管生成药物的靶点。含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的iRGD肽是一种环状的穿膜肽，与整合素αvβ3受体具有高亲和力，同时具有靶向Neuropilin-1受体和加速大分子物质(基因或药物)递送入肿瘤细胞的功能。iRGD穿膜肽能与肿瘤血管形成有关的整合素蛋白结合，然后这种肽被劈开，成为激活的CendR肽，后者与neuropilin-1相结合。CendR/neuropilin-1的结合调控着一种激活的运输系统，让同时注射的治疗物质从血管中渗出。这种倾注在血管外的肿瘤组织中继续发生，从而让治疗分子越来越深地渗透到肿瘤组织中。单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)，主要表达于单核细胞、上皮细胞和内皮细胞，是一类参与血管形成的趋化因子，许多肿瘤细胞均可分泌MCP-1因子促进肿瘤血管的生成，在乳腺癌、卵巢癌、胃癌、食管癌等肿瘤中MCP-1因子的分泌与肿瘤微血管的密度及侵袭能力密切相关。MCP-1介导血管生成的途径主要依赖于MCP-1与其特异性受体——CC类趋化因子受体2(CCR2)之间的相互作用。CCR2被发现在部分肿瘤血管内皮细胞上呈现高表达状态，MCP-1直接作用于内皮细胞上的CCR2受体，诱导内皮细胞趋化。MCP-1/CCR2的激活直接参与肿瘤血管的生成和进展，促进肿瘤的侵袭转移，且这种作用与内皮细胞上的CCR2受体表达情况呈正相关。

发明内容