[发明专利]一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法

权利要求书

1.一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法，其特征在于：包括以下工艺步骤：

(1)DSPE-PEG2000-iRGD的制各

①称量：按照摩尔比1.5∶1称量药品iRGD和DSPE-PEG2000-maleimide；

②溶解：将药品iRGD和DSPE-PEG2000-maleimide移入西林瓶中，加双蒸水4ml溶解，吹匀；

③反应：将装有药品的西林瓶置于冰块中，磁力搅拌24h；

④透析：取一大烧杯，装满蒸馏水，将反应后的溶液转移至透析袋内(Mw：3500)置于大烧杯内，将大烧杯维持在冰块环境中，磁力搅拌透析48h，每隔4h换一次双蒸水以及冰块；

⑤冷冻干燥：透析完毕后，将透析好的溶液转移至西林瓶中，置于-80℃中冻存约4h至固体，取出置冷冻干燥机中干燥48h；

⑥存放：干燥完毕后，封口，贴标签，于-20℃中保存；

(2)Stearic-PEI600的制备

①取0.35gN，N’-羰基二咪唑(CDI)和0.6g硬脂酸(Stearic)分别溶解于10ml无水氯仿中，0.7g支链PEI600溶解于20ml无水氯仿中，分别得N，N’-羰基二咪唑溶液、硬脂酸溶液、支链PEI600溶液备用；

②将①中所得的N，N’-羰基二咪唑溶液进行磁力搅拌，在不断磁力搅拌下，将①中所得的硬脂酸溶液逐滴加入N，N’-羰基二咪唑溶液中，得混合物溶液一，将混合物溶液在氩气保护下反应2小时后，再将其逐滴加入支链PEI600溶液中，得混合物溶液二备用；

③将②中所得的混合物溶液二在氩气保护下于室温环境中进一步搅拌24小时，所得产物在冷乙醚中沉淀纯化，然后放入大型离心机中清洗除去未反应的溶剂10min，收集上清液得到纯化的Stearic-PEI600；然后将清洗收集后的Stearic-PEI600溶液放入真空干燥机中干燥数小时，完毕后置于-20℃储物箱中保存，制备微泡时将其融于无水氯仿中使用；

(3)双靶向阳离子超声微泡的制备

①将DSPC、Stearic-PEI600、DSPE-PEG2000-iRGD、DSPE-PEG2000-Biotin溶解于三氯甲烷中，按摩尔比8.5∶0.5∶0.5∶0.5取上述配制的溶液于干净试管中，将试管置于旋转仪，使用干燥的N₂气流除去溶剂使其在试管壁上形成一层均匀的薄膜，真空烘箱中干燥3小时以上，备用；

②在试管中加入一定体积的Tris缓冲溶液，得到一定浓度的磷脂溶液，加热磷脂溶液到其相转变温度(55-60℃)以上，并用水浴超声制成透明的磷脂溶液，将所得磷脂溶液分装入洁净西林瓶中(1ml/瓶)，用全氟丙烷(C3F8)置换瓶中的空气，机械震荡器震荡30s后形成生物素化的阳离子MBiRGD微泡；

③将所得生物素化的阳离子MBiRGD微泡用PBS借助离心漂浮法清洗三次，然后加入60μg抗CCR2抗体孵育20分钟，离心清洗除去过量的未结合的抗体，制得携iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡。

2.根据权利要求1所述的一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法，其特征在于：制成所述超声微泡成分为：DSPC、DSPE-PEG2000-maleimide、DSPE-PEG2000-Biotin、iRGD肽、抗CCR2抗体、硬脂酸、支链聚醚酰亚胺-600、N，N’-羰基二咪唑、抗生物素蛋白。

3.根据权利要求1所述的一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法，其特征在于：所述纯化的Stearic-PEI600在大型离心机清洗时转数为3000rpm。

4.根据权利要求1所述的一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制各方法，其特征在于：所述Tris缓冲溶液含10％甘油和10％丙二醇，pH为7.4。

5.根据权利要求1所述的一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法，其特征在于：所述离心漂浮法清洗时，清洗速度设置为400g/min，每次清洗4min，所述生物素化的阳离子MBiRGD微泡用PBS进行离心漂浮法清洗之前，每1×108的生物素化的阳离子MBiRGD微泡加入50μg亲和素(AD)并在室温下孵育20分钟。