[发明专利]用于同时检测五种牛病病毒的多重连接探针扩增检测试剂盒及引物和探针

说明书

技术领域

本发明提供了一种用于检测蓝舌病、牛病毒性腹泻、牛地方流行性白血病、牛传染性鼻气管炎、口蹄疫病毒的多重连接探针扩增检测试剂盒及引物和探针，可实现一次采样，一次分析，同时检测5种牛病的目的，属于检验检疫领域。

背景技术

蓝舌病病毒(BTV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛地方流行性白血病病毒(EBLV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、口蹄疫病毒(FMDV)是引起牛呼吸道疾病、繁殖障碍和消化道疾病的主要常见病原，是危害养牛业最为严重的几种病原，被世界动物卫生组织(OIE)规定为跨界传播病原，也是我国动物及动物产品国际贸易中重要的检疫对象。

目前，针对上述5种牛病病原建立了多种分子检测技术，如PCR和荧光PCR技术等，在这些疫病的诊断和防控中发挥了重要作用。但目前所建立的方法多是针对一种病原的单目标检测，在实际检测中需要重复多次，才能完成检测不同病原的目的，检测工作量大且时间长，不能满足大批量动物检疫快速通关的实际需要。且难以实现实际样品中大量存在的混合感染以及症状相似疫病的鉴别诊断。在建立单目标病原检测技术的同时，各国兽医机构也相继研制了可同时检测牛常见病毒的多重PCR及多重荧光PCR，但传统PCR技术灵敏度低、结果不易判定等缺点限制了其在多重检测中的应用，而荧光PCR由于不同探针采用的荧光集团所发射的荧光存在相互干扰，且荧光PCR仪对不同波长荧光分辨的局限性也限制了荧光PCR多重检测技术的发展。

本研究利用多重连接探针扩增技术(Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)在核酸检测方面具有的特异、敏感，适合多重检测等优点，建立了BTV、BVDV、EBLV、IBRV、FMDV五种牛病病原的MLPA检测方法并组装成试剂盒，在国内外首次实现一次采样，一次分析，检测5种重要牛病的目的，不仅减少了检测的工作量和成本，且能在最短的时间内完成疫病的检测，为疾病防制赢得时间。

发明内容

本发明的第一个目的是提供特异性强、灵敏度高的同时检测蓝舌病病毒(BTV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛地方流行性白血病病毒(EBLV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和口蹄疫病毒(FMDV)的多重连接探针及一对通用引物。

本发明的另一个目的是提供快速、准确、使用方便的同时检测蓝舌病病毒(BTV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛地方流行性白血病病毒(EBLV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和口蹄疫病毒(FMDV)的多重连接探针扩增检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

在序列比对分析的基础上，针对蓝舌病病毒NS3基因、牛病毒性腹泻病毒5’UTR基因、牛地方流行性白血病病毒gP51基因、牛传染性鼻气管炎病毒gB基因、口蹄疫病毒3D基因，分别设计一对长探针和短探针(序列见表1)，同时设计一对PCR扩增的通用引物(序列见表2)。短探针由两段核苷酸组成，一段是PCR扩增的通用引物，一段是病毒特异性序列；长探针由三段核苷酸组成，除了PCR扩增的通用引物和病毒特异性序列外，在两者之间还加入特定大小的填充序列；且位于右侧的探针5’端进行磷酸化处理。通过在上述5种病毒的长探针中加入不同长度的填充序列，然后通过病毒模板变性、探针杂交、连接及通用引物PCR扩增得到不同大小的PCR产物，通过毛细管电泳分析后实现对5种病毒的同时检测。

表1 蓝舌病病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛地方流行性白血病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和口蹄疫病毒探针名称和序列

其中，上述SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的5’端进行磷酸化处理；

表2.通用引物序列