[发明专利]具有血管紧张素转化酶抑制活性的扁杏仁肽及其制备方法

说明书

本发明公开了两种具有血管紧张素转化酶抑制活性的扁杏仁肽及其制备方法，其中一种扁杏仁肽的氨基酸序列为Met‑His‑Thr‑Asp‑Asp，另一种扁杏仁肽的氨基酸序列为Gln‑His‑Thr‑Asp‑Asp。这两种扁杏仁肽是以扁杏仁为原料，先提取扁杏仁蛋白，将扁杏仁蛋白酶解得到扁杏仁总肽，再经葡聚糖凝胶层析、反相制备色谱分离得到。实验结果表明，这两种扁杏仁肽具有较高的血管紧张素转化酶抑制活性，前者对血管紧张素转化酶抑制活性的IC₅₀值为67.52±0.05μg/mL，后者对血管紧张素转化酶抑制活性的IC₅₀值为43.18±0.07μg/mL，且细胞毒性较低，因而可以作为降压药物。该发明为扁杏仁的深加工和降压肽的开发提供了新途径。

技术领域

本发明属于医用蛋白或肽/蛋白技术领域，具体涉及两种具有显著的血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性的扁杏仁肽及其制备方法。

背景技术

目前，天然生物活性肽研究的蛋白来源主要有：(1)植物性来源：大豆/豆粕、米糟、花生、杏仁等；(2)动物性来源：蚕丝、猪肉、鸡肉、动物皮/骨、动物毒液等。

生物活性肽的作用研究方向主要有：(1)抗高血压活性；(2)抗氧化活性；(3)抗血栓活性；(4)抗菌作用；(5)免疫作用；(6)拮抗与抗拮抗活性；(7)抗炎症作用等。

以上成果大多停留在色谱分析水平，没有制取到足够的纯净样品。有的仅进行了体外或细胞活性研究两者中的一项，不能充分证明产物的安全和有效性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供两种具有显著的血管紧张素转化酶抑制活性的扁杏仁肽，以及这两种扁杏仁肽的制备方法。

解决上述技术问题所采用的技术方案是：该扁杏仁肽的氨基酸序列为α-His-Thr-Asp-Asp，其中α代表Met或Gln。

本发明具有血管紧张素转化酶抑制活性的扁杏仁肽的制备方法由下述步骤组成：

1、提取扁杏仁蛋白

将扁杏仁依次经热水脱皮、粉碎、脱脂、溶剂提取、乙醇和等电点沉降法复合沉淀、冷冻干燥，得到扁杏仁蛋白。

2、蛋白酶解

将步骤1得到的扁杏仁蛋白先用Protamex复合蛋白酶水解，然后用Alcalase碱性蛋白酶水解，离心分离，上清液冷冻干燥，得到扁杏仁总肽。

3、葡聚糖凝胶层析

将步骤2得到的扁杏仁总肽与超纯水按质量体积比为30～50g:1L混合，脱气、超滤膜过滤后加入Sephadex G-15填充柱中，以超纯水为流动相，采用自动液相色谱分离层析仪进行分离，进样量2mL，流速3mL/分钟；收集19～40分钟所有流出成分，冷冻干燥。

4、反相制备色谱分离

将步骤3冷冻干燥后得到的产品与超纯水按质量体积比为40～60g:1L混合，用超滤膜过滤，超声脱气后，注射入制备色谱系统，进样量1mL，采用SinochromODS-BP色谱柱分离，洗脱相A为乙腈，洗脱相B为含0.05％三氟乙酸的超纯水，梯度洗脱程序：0～10分钟，20％乙腈；10～30分钟，20％～40％乙腈；30～40分钟，40％～70％乙腈；流速12mL/分钟；收集8.52～9.14分钟和14.87～15.26分钟流出的两种成分，冷冻干燥，得到氨基酸序列为Met-His-Thr-Asp-Asp和Gln-His-Thr-Asp-Asp的扁杏仁肽。

本发明的扁杏仁蛋白可根据现有文献公开的任意一种提取方法提取。