[发明专利]一种溯源鉴定8种动物源性成分的PCR方法

说明书

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种溯源鉴定8种动物源性成分的PCR方法，即利用PCR扩增反应同时鉴定山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼和牦牛源性成分。

背景技术

自古以来“民以食为天”，“食”也是中国文化的一部分。随着社会经济的发展和人们生活节奏的加快，食品的数量和种类发生了极大变化。西部地区多种特色肉类产制品如牦牛肉、大漠驼肉和鹿肉等也通过网络销售到了全国各地。这些肉类及其各种加工制品成为人们日常生活和休闲食品的重要来源和组成部分，但由于牛羊肉类及其产制品的价格较猪肉等制品的价格贵，国内外市场上“挂羊头卖狗肉”的事件时有发生，不仅损害了消费者的利益，同时还可能带来一些宗教信仰、消费诚信等社会问题。因此，国家监管部门先后颁布多项法律法规来规范这些食品加工销售的多个环节，也在技术上制定了一系列的检测标准和方法。

肉类的检验和溯源鉴定历经了感官检验和形态学检验的发展过程，这两种检验方法准确性低、局限度大，尤其对于深加工的肉类以及饲料中添加的动物源性成分基本无法鉴别。随后发展了肉类成分即蛋白和DNA的鉴定方法，在这个过程中基本确立了以特征性的核酸DNA作为靶标物质进行检验的思路，而核酸DNA尤其是线粒体DNA(mtDNA)具有耐热性强、不依赖于细胞形态、种间多态性好等特点，在物种鉴定中表现出更高的准确度和精度以及重复性，成为物种鉴定的首选对象。在现行国家标准中如猪、牛羊等多个物种的鉴定方法都是以mtDNA为靶标的DNA分析技术。

另一方面，现行国家标准大部分的检测方法中鉴定对象为单一物种或采用多重PCR方法同时检测2-3个物种，检测效率低且鉴定的物种数量少，对于牛、羊、猪和鹿的鉴定中大部分方法基于荧光定量PCR技术，存在对仪器要求高、试剂相对价格高等不足，对大批量未知成分的样品进行筛选鉴定的成本高、耗时长。金芜军等(金芜军，宛煜嵩，张秀杰，阮泓越，一种鉴别猪、牛、羊肉及其制品的方法，授权公告号CN 102337328 B)发明了一种鉴别猪、牛、羊肉及其制品的方法，提高了物种鉴定的效率。尽管国家标准和一些发明方法中可以实施对鹿肉和猪肉等鉴定，但是目前的物种鉴定方法中对牦牛肉、鹿肉和驼肉等产制品仍没有一种高效的鉴定方法。因此，建立一种简便易行且可以同时鉴定多种动物源性成分的的检测方法对于提高检测工作效率以及对未知动物源性成分的溯源鉴定都具有重要意义。本发明以mtDNA为检测靶标，经精细对比多个常见物种的mtDNA全序列，以物种的保守序列设计引物，扩增产物在各物种间存在插入-缺失片段，因此可通过分析PCR产物鉴定多个物种，提高了检测效率。本发明技术方法对于提高检验检疫部门监管工作效率和食品掺假样本调查鉴定方面都有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种溯源鉴定8种动物源性成分的PCR方法，即利用PCR扩增反应同时鉴定山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼和牦牛源性成分；从而弥补现有技术的不足。

本发明的方法，包括如下的步骤：

1)提取待检测样品的基因组DNA，将提取的样品基因组DNA溶于TE溶液中或纯水中保存备用；

2)利用PCR引物对检测样品的基因组DNA进行PCR扩增反应；

所用引物序列如下：

上通用上游引物:CCTCCCTAAGACTCAGGGAA(SEQ ID NO:1)、

通用下游引物:CGGAGCGAGAAGAGGGAT(SEQ ID NO:2)、

下游引物优选:CGGAGCGAGAAGAGG(SEQ ID NO:3)、

所述的引物还包括用于作为阳性对照的16S rRNA引物，序列如下：

上游引物：GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA(SEQ ID NO:4)、

下游引物：AAGACGAGAAGACCCTTGGACTTTA(SEQ ID NO:5)；

3)对PCR产物进行电泳检测，依据PCR产物条带大小和有无可判定检测样品中是否含有上述8种动物源性成分，其中山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼、牦牛扩增后获得对应片段大小分别为787bp、763bp、563bp、512bp、507bp、491bp、455bp和385bp。

作为优选，在步骤2)同时设置阳性和阴性对照组。

步骤2)的PCR反应程序如下：

95℃变性5min；95℃变性30s，退火61.5℃35s，72℃延伸30s为一个循环，共计30个循环；然后72℃保持10min。结束后降温至4℃。