[发明专利]一株高效转化富马酸生产L-天冬酰胺的工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株基因工程菌及其应用，以富马酸和氨水为底物一步法转化生产l-天冬酰胺，属于生物工程技术领域。

背景技术

l-天冬酰胺，又名天门冬酰胺、天门冬素、α-氨基丁二酸一酰胺（L-Asparagine，l-Asn），在食品、医药、化工合成等行业得到广泛应用。

在食品领域，l-天冬酰胺作为添加剂，与糖共热进行氨基-羰基反应，能形成特殊香味物质。用于清凉饮料。在医药行业，可以用于氨基酸输液及降压、平喘、抗消化性溃疡、胃功能障碍等，在生命科学领域研究中，常用于治疗心肌梗死、心肌代谢障碍、心力衰竭、心脏传导阻滞、疲劳等症，在微生物培养中也有添加。工业领域l-天冬酰胺可以用于医药中间体及化工原料进行合成化工，也可用于丙烯腈的污水处理等。

目前，l-天冬酰胺的制备方法主要是提取法和化学合成法。直接提取方法主要是从l-天冬酰胺含量高的羽扇豆和大豆的豆芽的水提取物分离而得，以白羽扇豆为原料，经发芽、成浆、加热处理等流程，在pH小于6的条件下，经硅藻土过滤、离心，获得粗品，随后经过浓缩、结晶获得成品，该方法受原材料质量因素影响大，并且工艺复杂不易控制，污染严重；化学合成法主要通过l-天冬氨酸与氢氧化铵进行酰胺化而得，化学方法存在普遍的污染大、副反应多等缺陷。

生物转化法在天冬酰胺生产领域的应用鲜有报道，虽然该方法具有反应条件温和、生产效率高、副产物少等优点，同时对设备的要求低、投资小、生产过程简单，易于操作控制，但是由于酶法催化过程需要ATP的参与，因ATP价格昂贵限制了生物转化法的应用，目前未进入产业化阶段。

发明内容

本发明提供一株可以同时产生l-天冬氨酸酶和l-天冬酰胺合成酶的基因工程菌株E.coli11022S/pET28-asnACICC11033S，利用菌体细胞ATP再生体系，转化富马酸和氨水生产l-天冬酰胺，以替代现有l-天冬酰胺生产工艺，实现绿色生产。

本发明成功实现了将asnA基因在携带l-天冬氨酸酶基因的E.coliCICC11022S（等同于CMGCCNo.5450）宿主菌中的高效表达，并以此基因工程菌株转化富马酸和氨水生产l-天冬酰胺，具有原料成本低、生产过程简易、简便高效等特点（附图1）。

本发明底物富马酸、中间产物l-天冬氨酸及终产物l-天冬酰胺的定量测定分析采用柱前衍生-高效液相色谱方法（HenderJW,etal.,Rapid,accurate,sensitiveandreproducibleHPLCanalysisofaminoacids.AgilentTechnologies.USA.2000）。

本发明具有的突出特点是：

（1）本发明应用同时表达l-天冬酰胺合成酶和l-天冬氨酸酶的E.coli11022S/pET28a(+)-asnACICC11033S菌株转化富马酸和氨水生产l-天冬酰胺。

（2）本发明方法成功降低了原料的成本。

（3）本发明方法构建的基因工程菌生产l-天冬酰胺的过程简便，易于操作。

（4）本发明的基因工程菌生产l-天冬酰胺，转化率为94.7%，产量可达125.1g/L，生产速率12.51g/(L·h)。

附图说明

图1工程菌CICC11033S转化富马酸生产l-天冬酰胺示意图。

图2工程菌CICC11033S全细胞高密度催化生产l-天冬酰胺。

具体实施方式

实施例1.菌株E.coli11022S/pET28-asnA的构建