[发明专利]玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的特异SSR标记及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的特异SSR标记及其应用，属于植物育种技术领域。

背景技术

C₄植物具有光呼吸低、氮素和水分利用效率高、光能利用效率高的优点，C₄光合相关酶在对生物和非生物逆境(如机械创伤、低温、盐害及紫外辐射等)的防御反应中也有较重要的作用。由于主要粮食作物如水稻、小麦等C₃植物不具有这些优势，人们就希望将C₄这些优势特征引入水稻等C₃作物中。PEPCase是C₄途径的关键酶，国内外对该基因的研究报道也比较多，已有不少将玉米PEPC基因成功转入水稻中的报道(Hudspeth等，1992；Ku等，1999；焦德茂等，2001；李霞等，2001；王德正等，2002；何立斌等，2006；袁定阳等，2007；向珣朝等，2009；周宝元等，2011；李万昌等，2014)。这些转基因水稻的CO₂补偿点和光呼吸速率显著降低，表观净光合速率提高，产量也有不同程度的提高。

为了加快转玉米PEPC基因水稻的选育进程，利用分子标记进行辅助选择是一种比较快速、适用的技术。很多研究开发了玉米PEPC基因分子标记并进行基因检测(刘峰等，2005；何立斌等，2006；高东迎等，2006；袁定阳等，2007；丁在松等，2007；张边江等，2008；张彬等，2009；李艳等，2009；张庆琛等，2010；张建红等，2012；杜西河等，2013)，但这些分子标记的碱基序列要么位于非编码区，要么跨叠非编码区，不利于基因表达分析(转基因的重要目的之一就是希望目的基因能正常表达)；而且这些标记在不同玉米品种(系)之间或者不同水稻品种之间存在着差异，不能快速、简单、高效地区分所有玉米PEPC基因与水稻PEPC基因的差异。由于PEPC基因广泛存在于各种植物中，如玉米、高粱、稗草、栽培稻、短花药野生稻、大麦、普通小麦、狗尾草、弓果黍、芦苇、二穗短柄草、松叶菊属、羽毛针禾等植物，但现在转C₄-PEPC基因的研究主要集中在转不同玉米的PEPC基因上，且截止目前还未见只针对玉米PEPC基因筛选通用分子标记的报道。本研究以经典玉米品系B73的PEPC(NC_024463)基因为例进行开发玉米特异SSR标记的探索。该玉米PEPC基因包含10个外显子和9个内含子，首先将10个外显子序列逐一在NCBI数据库进行比对，发现这10个外显子不但在不同物种(如玉米、水稻、小麦、高粱、大麦、稗草等)之间存在着明显的差异，而且在不同玉米品种(系)之间都存在着一定差异，即使一些片段比较长的外显子(如第2、4、8、9和10外显子)和片段大小一般的外显子(如第1和5外显子)在不同玉米品种(系)上也存在着很多差异位点，如缺失、插入、错配(相对于B73的碱基序列而言)，导致这些位置无法进行玉米特异SSR标记的设计；第3外显子(936-1020，85bp)和第6外显子(2960-3047，88bp)不但片段比较小(不适于SSR标记的设计)，而且在不同玉米品系上也存在着差异；最初比对第7外显子(4717-4871，155bp)时发现黍族的Zuloagaeabulbosa植物与该玉米在碱基序列一致，但仔细分析发现它在已知的玉米品种PEPC基因序列里面至少有152bp(除与玉米品系Z561前3个碱基aat没有比对上外，截止2015年6月22日的NCBI数据)的序列是完全一致的，然而该外显子在NCBI数据库水稻基因组中也没有发现较为接近的比对结果。我们试着对该外显子进行SSR引物设计，然后选择不同玉米和水稻品种进行PCR扩增，结果意外地发现该引物(命名为PC9)在所有玉米材料中都能扩增出预期长度为131bp的片段(图1)，而在所有不同水稻品种中则能扩增出大约340bp的片段(图2)，通过该引物完全可以区分水稻与玉米PEPC基因的差异，即可用于转玉米PEPC基因到水稻中的辅助选育，从而有利于加快育种进度和提高选择效率。

主要参考文献：

1.Hudspeth等，PlantPhysiology，1992，98(2):458-464；

2.Ku等，NatureBiotechnology，1999，17:76-80；

3.焦德茂等，作物学报，2001，27(2):137-143；

4.李霞等，江苏农业学报，2001，17(3)：143-147；

5.王德正等，中国农业科学，2002，35(10)：1165-1170；