[发明专利]一种基于稀有细胞检测HER-2/CEP17基因状态的方法及相关试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及医学诊断学，特别涉及肿瘤细胞的检测。更具体地讲，本发明涉及检测癌症和评估患者的治疗方案的诊断方法。

背景技术

循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCell,CTC)指进入到血液循环中的肿瘤细胞，其可由原发灶或转移灶脱落入血，亦可能在形成实体瘤病灶之前进入血液中。肿瘤细胞侵入循环系统，大部分由于机体的免疫识别、机械杀伤及自身凋亡在短期内死亡，只有极少数存活下来，并在远端或原发组织及器官种植，进一步发展为转移灶，是导致肿瘤转移和复发的最直接因素。

CTC作为一种可以代表原发肿瘤的“液体活检”样本，外周血标本易获取、创伤性小、可反复采集，是临床检测更为理想的标本来源，可对肿瘤治疗进行实时全面监测。可有效实现肿瘤复发预警，疗效及时评价以及肿瘤个体化治疗用药指导，目前CTC检测已广泛运用于临床肿瘤患者的疗效实时评价、病情实时监测、耐药析因、预后判断中。

荧光原位杂交(fluorescentinsituhybridization，FISH)是一种细胞遗传学技术，可以用来对核酸进行检测和定位。目前基于脱落稀有细胞的FISH技术一般为定性检测，很难做到精准定量且保证其效果。究其根本原位在于目前适用于组织标本的FISH检测方法及普通的脱落细胞学FISH检测方法，当数量级在0-100间的细胞涂片后，无法在着色效果和有效保持细胞方面取得较好的平衡并保持较高的稳定性，更难以形成有效稳定定量检测的成型产品。目前虽有相应专利阐述一种有效方法(US6,524,798)，但需极其高昂成本的专用检测设备，无法在常规实验室完成这基于及少量稀有细胞、甚至是单细胞层面的FISH检测工作。

此前已描述了来自生物样品的肿瘤细胞、稀少细胞或其他生物实体的鉴定方法(如中国专利申请号：200810097889.4、201310057307.0)。此两步法要求有效富集以确保在分析之前获取靶细胞，同时去除大量碎片和其他干扰物质，使得可通过成像技术进行细胞检验。此方法以独特的阴性富集策略将免疫磁微粒与多密度离心方式、荧光原位杂交和免疫荧光细胞化学分析组合起来，精确定量地检测几乎所有实体肿瘤类型中脱落至含血液、胸/腹腔积液、尿液、脑脊液等多种生物体液标本中的稀有细胞(含CTC)。此组合方法用于富集和计数血样中的染色体扩增型肿瘤细胞，因此提供了一种量度癌症的工具。

原癌基因人类表皮生长因子受体2(HER-2)基因，即c-erbB-2基因，定位于染色体17q12-21.32上，编码相对分子质量为185000的跨膜受体样蛋白，具有酪氨酸激酶活性。目前基于HER-2基因的检测，广泛应用于乳腺癌、胃癌等恶性肿瘤的预后分析，尤其是基于HER-2靶点的曲妥珠单抗(商品名：Herceptin)药物的临床应用方面。

《乳腺癌HER-2检测指南》中指出乳腺癌HER-2检测方法及报告推荐用两种方法检测乳腺癌HER-2，即检测蛋白的免疫组化法(IHC)和检测基因的荧光原位杂交(FISH)法，该指南建议，HER-2检测FISH报告主要包括:所计数的浸润癌细胞数量、平均每个细胞核中HER-2信号数量、平均每个细胞核中CEP17信号数量、平均每个细胞核中HER-2和CEP17信号数量的比值。

但是临床检测时，会由于例如已手术切除、患者主观意愿不胁从等诸多无法有效获得肿瘤组织的情况，而存在以下局限性：

1、作为有创性且受限于病灶位置的组织学检测，存在标本取材不易或无法取材等局限性，且术后不能反复取材，导致组织取材无法提供实时性的监测信息。

2、且受治疗的影响等，肿瘤细胞的分子信息有可能发生动态改变。如：有研究报道，接受新辅助化疗的乳腺癌患者，在化疗前接受活检，并将结果与术后病理进行对照，发现存在治疗前后HER-2表达不一致的情况。

3、肿瘤组织异质性的存在以及单点活检造成的只是局部信息反映的现状，使得传统组织学检测缺乏全面整体性的评价，如原发灶、多发转移灶信息的综合评价等。

本发明在于提供了一种检测CTC或其他稀有细胞的同时对HER-2/CEP17的数量及比值进行检测的方法。以获得更加全面的信息。本发明在分离获取血液中CTC(或其他稀有细胞)的基础上，进行单细胞分子分析，检测HER-2表达情况，以此来从单细胞水平上，即时地发现HER-2的分子信息，以便对患者的状态进行实时观察。

发明内容