[发明专利]一种用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

1.1穿梭质粒的构建：

将MAGE-3基因克隆到pIIIdHR-P7.5质粒中；

1.2重组MVA病毒的构建：

a.用MVA病毒感染细胞，培养90~120min，得到感染细胞；

b.在感染开始15~30min后，开始准备转染质粒，得到转染质粒混合液；

c.将所述转染质粒混合液加入上述感染细胞中，37℃培养24~48h，得到单层细胞；

d.反复冻融所述单层细胞2-3次，并将细胞破碎处理2-5次，得到rMVA溶液；

e.将所述rMVA溶液接种到细胞中，37℃培养48~72h；

f.挑取典型的rMVA感染的细胞聚集点到新的含培养基中，挑取5~15个所述聚集点；

g.重复上述步骤d至步骤f，2~4次，直到得到较纯的rMVA；

h.将所述rMVA培养于单层细胞中，筛选不含选择基因K1L的rMVA，重复步骤d至步骤g，2~4次，直至筛选得到rMVA-FS；

i.扩增分离得到的重组MVA-MAGE-3病毒，即为所述的用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗。

2.一种用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

1）按照权利要求1所述的方法制备得到重组MVA-MAGE-3病毒；

2）特异性递呈MAGE-3抗原DC细胞的获得；

2.1将未成熟的DC细胞以1×10⁶/ml铺入6孔板；

2.2重组MVA-MAGE-3病毒以MOI=0.3感染未成熟DC，感染1~3h后，每孔加入含hTNF-α、IL-6和IL-1β的20%FBSAIMV培养基，继续培养24~48h，得到成熟特异性递呈MAGE-3抗原的DC细胞，即为所述的用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗。

3.根据权利要求1所述的用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1.1中所述的MAGE-3基因来源于A549细胞RNA的逆转录。

4.根据权利要求1所述的用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1.2a和1.2h中所述的细胞为CEF细胞或BHK-21细胞。

5.根据权利要求1所述的用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1.2e中所述的细胞为RK-13细胞。

6.根据权利要求3-5所述的用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述A549细胞、BHK-21细胞和RK-13细胞，均使用含10%热灭活FBS的RPMI-1640培养基培养于37℃，5%CO₂条件下，病毒感染时，FBS浓度要降低到2%。

7.根据权利要求4所述的用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述CEF细胞取自11天龄SPF级鸡胚，培养于含10%热灭活FBS和25μg/mlamphothericinB，1%AB/AM。

8.根据权利要求1所述的用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1.1a中所述的MVA病毒感染细胞，以MOI=0.01-0.05感染MVA，培养基为RPMI-1640/2%FBS/1%AB/AM。

9.一种用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗，其制备方法如权利要求1~8所述。