[发明专利]一种G蛋白‑偶联受体活体示踪方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子影像学领域，具体地说新型G蛋白-偶联受体(G Protein-Coupled Receptor，GPCR)活体示踪方法，以人视紫红质为例，具体说明在其非功能区即第一个胞内环(Cytoplasmic Loop 1，CL1)中插入一分子eGFP，成功构建一种新型rhodopsin^CL1-eGFP融合蛋白，通过荧光检测rhodopsin在细胞内分布。

背景技术

G蛋白-偶联受体(G Protein-Coupled Receptor，GPCR)是存在于细胞膜上的参与细胞信号转导的重要蛋白，参与多种重要的生理过程，如突触传递、细胞的增殖和分化以及味觉和触觉的感知等。GPCR均由七个跨膜螺旋构成，螺旋之间由三个胞内环和三个胞外环连接，其N端一般与蛋白的插膜密切相关，而其C端一般是磷酸化位点并参与下游G蛋白的激活，因此具有重要的作用。由于GPCR的重要作用，GPCR突变能导致多种疾病的发生。由于GPCR为真核蛋白，它一般会经历复杂的糖基化加工和折叠过程，只有最终折叠正确的蛋白才能经历从内质网到高尔基体，最后成功插入细胞膜的完整过程。当GPCR突变后，轻者蛋白构象发生改变，重者能引发蛋白的错误折叠，导致蛋白不能正确的插膜，甚至在细胞内发生聚集，并造成细胞死亡等严重后果。因此，GPCR的分子成像具有重要的价值，它能反应GPCR是否正确插膜、表达水平高低以及是否聚集等丰富的信息，这对于研究GPCR相关的疾病具有重要的意义。

传统的分子成像方法有组织染色或免疫染色、免疫荧光等方法。即通过特异性的染料或荧光标记特异性抗体结合目标分子，最后借助显色反应或荧光检测来观察目标分子的分布。但上述方法仅适用于固定之后的组织和细胞，无法应用于活体细胞或组织。荧光蛋白的出现极大地带动了分子活体示踪的发展，人们把荧光蛋白和目标蛋白进行融合表达，最后通过荧光在活体细胞或组织中直接观察目标蛋白的分布。绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)具有荧光强度大，干扰因素少，发光稳定等优点，是目前广泛应用的一种荧光蛋白。因此，GPCR-GFP融合蛋白是GPCR分子活体示踪的首选策略。

视紫红质(rhodopsin)是广泛存在于脊椎动物视网膜视杆细胞细胞膜上的光受体蛋白，它由一分子配体视黄醛(retinal)和一分子视蛋白(opsin)构成，属于GPCR Class A家族。受到光照刺激后，视黄醛发生异构，促使视紫红质蛋白发生一系列的构象变化，并激活下游的信号传导，继而产生一个传向视神经的信号，最终导致视觉的发生。视紫红质一共有348个残基，但其中有100多个位点的突变与先天性眼病的发生密切相关，如视网膜色素变性和夜盲症等，除少数突变体视紫红质已经得到深入研究外，大部分的视紫红质突变体的研究还处于一片空白。因此探索视紫红质突变与眼病的发生仍具有巨大的发展空间。

研究视紫红质在细胞内的分布、转运和表达水平等对于探索视紫红质突变与眼病的发生具有重要的价值。如导致北美人视网膜色素变性最常见的视紫红质P23H，由于突变后的蛋白发生了严重的错误折叠，因此被滞留在内质网中，无法被正常转运到细胞膜上，所以无法执行正常的光受体蛋白功能。P23H的致病原理在细胞水平和动物水平都得到了广泛的验证，这主要得益于rhodopsin-GFP融合蛋白的建立，人们可通过GFP在细胞或视网膜中直接观测rhodopsin的分布。现有技术一般把GFP连接在rhodopsin的C端(CT)，其目的是避免对其N端的干扰，从而达到不影响rhodopsin^CT-GFP的插膜的目的。但是由于rhodopsin的C端受到干扰，与野生型rhodopsin相比，rhodopsin^CT-GFP的G蛋白转导功能和磷酸化效率大大降低，与野生型rhodopsin有着巨大的差距。显然，rhodopsin^CT-GFP不是一个理想的融合表达策略。