[发明专利]一种G蛋白‑偶联受体活体示踪方法及应用

权利要求书

1.一种G蛋白-偶联受体活体示踪方法，其特征在于该方法是：在G蛋白-偶联受体GPCR的非功能区插入一分子增强型绿色荧光蛋白eGFP，实现GPCR-eGFP融合表达，通过荧光检测GPCR在活体细胞中的分布。

2.如权利要求1所述的活体示踪方法，其特征在于所述在G蛋白-偶联受体GPCR的非功能区插入一分子增强型绿色荧光蛋白eGFP，是在不干扰GPCR功能的前提下，对GPCR分子实现荧光标记，实现GPCR分子的活体实时观测。

3.一种新型人视紫红质即rhodopsin和增强型绿色荧光蛋白eGFP融合表达方法，其特征在于该方法是：在rhodopsin的第一个胞内环区CL1插入一分子eGFP，构建rhodopsin^CLl-eGFP；具体包括以下步骤：

1)利用分段PCR法在rhodopsin的第一个胞内环区引入一个单点突变K66M，即把第66位的残基赖氨酸突变为甲硫氨酸，在rhodopsin中引入一个独特的Nde I酶切位点CATATG；

2)pCEP4-rhodopsinK66M质粒转染HEK293S细胞，通过Western Blot条带确定rhodopsinK66M与野生型rhodopsinWT在表达量和糖基化加工方面相似，从而确定K66是非关键残基，该位置适合eGFP的插入；

3)通过PCR法从pcDNA3.1-3’-eGFP上扩增出两端带有Nde I酶切位点的eGFP基因，然后经Nde I单酶切后，胶回收Nde I酶切后的eGFP基因；

4)由于pCEP4质粒上含有多个Nde I酶切位点，不适合进行单酶切实验，用BamH I和Hind III双酶切实验和T4连接酶连接实验把rhodopsinK66M从pCEP4质粒转接到pBAD24质粒上得到pBAD24-rhodopsinK66M质粒；

5)对pBAD24-rhodopsinK66M质粒进行Nde I单酶切后，再用牛小肠碱性磷酸酶CLAP处理，防止pBAD24-rhodopsinK66M质粒在连接实验中的自连；

6)T4连接酶连接步骤3)中的Nde I酶切后的eGFP基因和步骤5)中的经Nde I酶切和牛小肠碱性磷酸酶处理后的pBAD24-rhodopsinK66M质粒，将连接产物转化大肠杆菌Top10菌株，然后通过菌落PCR法筛选出eGFP正向插入的克隆，最后通过测序进一鉴定构建的pBAD24-rhodopsinK66M-eGFP即pBAD24-rhodopsin^CLl-eGFP质粒；

7)测序正确后，再次通过BamH I和Hind III双酶切实验和T4连接酶连接实验把rhodopsin^CLl-eGFP从pBAD24质粒转接到pCEP4质粒上，得到pCEP4-rhodopsin^CL1-eGFP质粒；

8)将pCEP4-rhodopsin^CLl-eGFP质粒转染到HEK293S细胞中，通过Western Blot和荧光实验鉴定rhodopsin^CLl-eGFP的表达。

4.如权利要求3所述的融合表达方法，其特征在于所述rhodopsin^CL1-eGFP，避免了eGFP对rhodopsin的重要功能区C端的干扰，是一种改进后的rhodopsin荧光报告蛋白，更适合rhodopsin相关眼病的活体研究。