[发明专利]一种麦芽糖诱导型海藻糖合酶合成工程菌及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种麦芽糖诱导型海藻糖合酶合成工程菌及其制备方法与应用，特别涉及一种麦芽糖诱导型重组枯草芽孢杆菌生产海藻糖合成酶及制造海藻糖的方法，属于生物技术技术领域。

背景技术

海藻糖是一种非还原性二糖，分子式是C₁₂H₂₂O₁₁·2H₂O，广泛分布于自然界中许多生物细胞中。海藻糖自身性质非常稳定，通常在环境胁迫条件下大量生产，并对多种生物活性物质起到保护剂的作用。随着社会的进步和人们生活水平的提高，海藻糖逐渐的被广泛应用于食品和医疗行业，加大了人们对海藻糖的要求。因此，大规模的高效、安全、廉价生产海藻糖具有极大的经济价值，同时也将更能推广和普及海藻糖在食品领域的使用。

枯草芽孢杆菌启动子是实现基因高效表达的关键元件之一。近年来，在启动子的研究方面开展了大量的工作并取得了长足的进展，克隆获得了一批可以应用于枯草芽孢杆菌的启动子。但是，枯草芽孢杆菌的现有启动子在数量、表达量和调控方式等方面存在着诸多问题。需要进一步研究和完善，获得更多表达强度高，诱导调控方便的启动子元件。

在枯草芽孢杆菌中常用的启动子系统有Pspac、Pxyl和PsacB系统，这三个启动子系统在枯草杆菌研究工作中应用很广，但它们也有自己的缺点：Pspac启动子的诱导物IPTG不仅成本高，而且有毒性；Pxyl启动子的诱导物木糖价格高，易增加生产成本；sacB启动子的表达量相对较低。这些缺陷使得它们在工业生产中有一定的局限性。

为了使海藻糖合成酶酶制剂应用到食品医疗行业，我们应用枯草芽孢杆菌中的麦芽糖启动子，也具有很好的应用潜力。整个麦芽糖操纵子的转录过程是由结构基因上游的Pglv启动子控制，该操纵子包括三个结构基因glvA、glvR、glvC，这三个基因在调控上起到重要作用。glvA基因是编码水解通过磷酸烯醇式丙酮酸转移酶系统(PTS)转运到细胞内的磷酸化的麦芽糖的6-磷酸-α葡萄糖苷酶。glvR基因则是整个操纵子的关键基因，该基因编码的调控蛋白可通过结合磷酸化的麦芽糖而被激活，激活的调控蛋白的N末端与麦芽糖启动子glv序列结合，促进了该启动子的转录表达，起到了正向调控的作用。glvC编码的渗透蛋白是组成磷酸烯醇式丙酮酸系统组件，在转运麦芽糖过程中起到渗透作用。

Pglv系统的诱导物麦芽糖相对于IPTG和木糖来说，价格便宜，成本低，且对细菌本身无毒性，因此在工业上很有实用价值。此外，研究启动子对于枯草芽孢杆菌的基因组以及分子遗传的研究工作也有着十分重要的意义。但其同时也存在着不足，葡萄糖对表达系统枯草 芽孢杆菌B.subtilis有强烈的抑制作用，这与Pglv启动子的性质相符。Pglv启动子碳水化合物异化代谢的调控元件受葡萄糖的负反馈抑制，通过启动子的优化，解除葡萄糖对Pglv启动子的抑制应该是进一步提高Pglv启动子的表达强度，拓展其应用价值的有效策略。

对于用Pglv启动子诱导海藻糖合成酶产生来说，该麦芽糖诱导物即能够诱导海藻糖合成酶产生，反过来得到的海藻糖合成酶以麦芽糖为底物直接转化为海藻糖，增加了海藻糖合成酶的转化率，对于制造海藻糖来说具有重要意义。

Bacillus subtilis是很有潜力的分泌型基因工程菌，Bacillus subtilis分泌表达蛋白质主要有两种途径，一种是Sec(Sec-dependent translocation)途径，一种是Tat(twin-arginine translocation)途径。Sec途径主要有两个瓶颈：一是不能转移在细胞质中已经折叠好的蛋白质，另一个是外源蛋白转移到胞外后折叠缓慢且来不及折叠就会被蛋白酶分解掉。而Tat途径的功能是转运那些折叠迅速或紧密的蛋白质甚至是多亚基酶复合物，这些蛋白无法通过Sec途径分泌，同时依赖于Tat途径分泌到胞外，减少了胞外蛋白酶对它的降解。而YwbN信号肽和PhoD信号肽是枯草芽孢杆菌中最具有代表性的Tat信号肽，对于麦芽糖诱导海藻糖合成酶合成、分泌来说具有重要的作用。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种麦芽糖诱导型海藻糖合酶合成工程菌及其制备方法与应用。

本发明技术方案如下：

一种重组质粒载体，其特征在于，在PHT01质粒的BamHI酶切位点前插入麦芽糖诱导启动子替换PHT01质粒上的的Pgrac启动子，在BamHI酶切位点前插入Tat型信号肽的表达基因，在BamHI酶切位点后插入海藻糖合成酶的表达基因；